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.2009年3月；119(3):582-94.
doi:10.1172/JCI37409。 Epub 2009年2月16日。

腺苷信号通路参与乙醇诱导的小鼠脂肪肝

彭仲生 1, 安德烈亚·博雷码头, 卡蒂亚·瓦拉尼, 图尔·怀尔德, 赫尔曼·耶伊, 路易斯·奇里沃加, 迈克尔·布莱克本, 吉安弗兰科·阿泽纳, 朱塞佩·雷斯塔, 布鲁斯·克伦斯坦
附属公司

腺苷信号通路参与乙醇诱导的小鼠脂肪肝

彭仲生等。 临床研究杂志. 2009年3月.

勘误表in

  • 临床投资杂志。2009年4月；119(4):1052. 卡蒂亚·瓦拉尼[新增]

摘要

脂肪肝通常与酒精摄入和滥用有关。虽然这些脂肪变化的分子发病机制已经很清楚，但乙醇刺激这些分子变化的生化和药理机制仍然未知。在乙醇代谢过程中，腺苷由胞外-5’-核苷酸酶产生，已知腺苷的产生和腺苷受体的激活在肝纤维化的发展中起着关键作用。因此，我们研究了腺苷及其受体是否在酒精诱导的脂肪肝的发展中发挥作用。在Lieber-DeCarli饮食中摄入乙醇的WT小鼠出现了肝脂肪变性，包括肝甘油三酯含量增加，而缺乏外切-5’-核苷酸酶或腺苷A1或A2B受体的小鼠受到保护，不会出现脂肪肝。用腺苷A1或A2B受体拮抗剂治疗的WT小鼠也有类似的保护作用。脂肪肝显示脂肪酸合成相关基因的表达增加，这是由腺苷A1受体的阻断所阻止的，脂肪酸代谢相关基因表达减少，这是通过腺苷A2B受体的阻断而阻止的。体外研究支持腺苷A1受体在促进脂肪酸合成和A2B受体在降低脂肪酸代谢中的作用。这些结果表明，乙醇代谢产生的腺苷通过A1和A2B受体在乙醇诱导的肝脂肪变性中起着重要作用，并提示靶向腺苷受体可能有效预防酒精诱导的脂肪肝。

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数字

图1
图1。删除外-5′-核苷酸酶可阻止小鼠乙醇诱导脂肪肝的发展。
给8周龄雄性小鼠（WT和CD73KO小鼠）喂食含乙醇的液体饮食或含麦芽糖的等热量饮食6周。然后在第六周结束时处死小鼠，收集它们的肝脏并用H&E和油红O染色。在处死当天称重小鼠的肝脏和身体，并计算肝脏/全身重量比。如方法所述，还测量了血清AST和甘油三酯以及肝组织甘油三酸酯水平。肝脂肪变性分级基于H&E染色肝切片中脂肪肝细胞的百分比。(A类)麦芽糖和乙醇处理的WT和CD73KO小鼠的H&E染色肝脏切片（原始放大倍数，×400）。(B类)乙醇处理的WT和CD73KO小鼠的肝脏脂肪变性等级。麦芽糖处理的WT和CD73KO小鼠的脂肪变性等级为0。(C类)WT和乙醇处理的WT和CD73KO小鼠的油红O染色肝脏切片（原始放大倍数，×400）。(D类)CD73KO和WT小鼠的肝脏/体重比。(E类)WT和CD73KO小鼠的血清AST水平。(F类)WT和CD73KO小鼠的血清甘油三酯水平。(G公司)WT和CD73KO小鼠的肝组织甘油三酯水平。#P（P）<0.01，CD73KO小鼠对WT小鼠*P（P）<0.01，不同组中乙醇小鼠与对照小鼠的比较**P（P）<0.01，乙醇CD73KO小鼠与对照WT小鼠或乙醇WT小鼠的比较；n个=每组小鼠5-10只。
图2
图2。腺苷A缺失1或A2B型受体保护小鼠免受乙醇诱导的脂肪肝的侵袭。
将8周龄雄性小鼠（WT、A1KO、A2BKO、A2 AWT和A2AKO小鼠）喂食含乙醇的液体饮食或含麦芽糖的等热量饮食6周，然后处死。在献祭当天称重小鼠的肝脏和身体，并计算肝脏/总体重比。如方法所述，还测量了血清AST和甘油三酯以及肝组织甘油三酸酯水平。肝脂肪变性分级基于H&E染色肝切片中脂肪肝细胞的百分比。(A类)麦芽糖和乙醇处理的A1KO、A2BKO、A2 AWT和A2AKO小鼠的H&E染色肝脏切片（原始放大倍数，×400）。(B类)乙醇处理的A1KO和A2BKO小鼠的油红O染色肝脏切片（原始放大倍数，×400）。(C类)乙醇处理的WT、A1KO、A2BKO、A2 AWT和A2AKO小鼠的肝脏脂肪变性等级。麦芽糖处理的WT、A1KO、A2BKO、A2 AWT和A2AKO小鼠的脂肪变性等级为0。(D类)肝脏/体重比。(E类)血清AST水平。(F类)血清甘油三酯水平。(G公司)肝组织甘油三酯水平。#P（P）<0.01，分别为A1KO小鼠或A2BKO小鼠与WT小鼠*P（P）<0.01，不同组中乙醇小鼠与对照小鼠的比较**P（P）<0.01，分别为乙醇KO小鼠与对照KO小鼠或对照WT小鼠或乙醇WT小鼠；n个=每组小鼠5-10只。
图3
图3。腺苷A的阻断1或A2B型受体保护小鼠免受乙醇诱导的脂肪肝的侵袭。
将8周龄C57BL/6雄性小鼠喂食含乙醇的液体饮食或含麦芽糖的等热量饮食，并补充a1受体特异性拮抗剂DPCPX，A2B型受体特异性拮抗剂enprofylline（enpro）或载体，然后处死。在献祭当天称重小鼠的肝脏和身体，并计算肝脏/总体重比。如方法所述，还测量了血清AST和甘油三酯以及肝组织甘油三酸酯水平。肝脂肪变性分级基于H&E染色肝切片中脂肪肝细胞的百分比。(A类)DPCPX或恩丙氨酸处理小鼠肝切片的H&E和油红O染色（原始放大倍数×400）。(B类)肝脂肪变性分级。(C类)肝脏/体重比。(D类)血清AST水平。(E类)血清甘油三酯水平。(F类)肝组织甘油三酯水平。#P（P）<0.01，DPCPX或enprofylline处理的乙醇小鼠与不同组的乙醇小鼠的比较*P（P）<0.01，不同组中乙醇小鼠与DPCPX或恩丙氨酸处理的乙醇小鼠的比较**P（P）<0.01，DPCPX或恩丙氨酸处理的乙醇小鼠与不同组的对照小鼠之间的差异；##P（P）<0.05，DPCPX或恩丙氨酸处理的乙醇小鼠与不同组的对照小鼠之间的差异；n个每组5-10人。
图4
图4。乙醇摄入增加CD73型和A1R公司,A2aR公司、和A2bR型mRNA表达，并调节肝转录因子SREBP1和PPARα的表达，以及参与脂肪酸合成、代谢和运输的肝酶和转运体。
通过实时PCR评估肝组织中基因的mRNA表达，并将其归一化为GAPDH。(A类)mRNA表达CD73型腺苷受体（%，与对照组相比）。(B类)mRNA表达Srebp1号机组. (C类)mRNA表达Ppara公司. (D类)mRNA表达Pparg公司. (E类)mRNA表达国际计算语言学协会. (F类)mRNA表达Fas公司. (G公司)mRNA表达阿卡. (H（H）)mRNA表达Cpt1号机组. *P（P）<0.01，乙醇组与对照组之间的差异**P（P）<0.01，DPCPX或恩丙氨酸处理小鼠与乙醇WT小鼠的比较；n个=每组5人。
图5
图5。腺苷A1和A2B型激动剂促进培养的小鼠肝细胞系（AML-12细胞）中的脂肪积累。
用腺苷受体激动剂或拮抗剂或其组合（A1受体激动剂CPA，1μM；DPCPX，1μM；A类2安培受体拮抗剂ZM 241385[ZM]，1μM；非选择性和A2B型受体激动剂NECA，10μM；A类2B型受体拮抗剂MRS1706，1μM；A类三受体拮抗剂3-乙基-5-苄基-2-甲基-4-苯乙炔基-6-苯基-1,4-（±）-二氢吡啶-3,5-二羧酸[MRS1191]，1μM）24小时，然后用油红O染色，或收集并测量细胞甘油三酯含量。(A类)AML-12肝细胞油红O染色（原始放大倍数，×400）。(B类)AML-12细胞甘油三酯含量与CPA浓度的曲线。(C类)AML-12细胞甘油三酯含量随NECA浓度的变化曲线。(D类)CPA或拮抗剂或CPA联合拮抗剂治疗后AML-12细胞的细胞甘油三酯含量。(E类)NECA或NECA联合拮抗剂治疗后AML-12细胞的细胞甘油三酯含量。数据表示为4个独立实验的对照百分比（平均值±SD）*P（P）<0.01，CPA或CPA+ZM、MRS1706或MRS1191或NECA或NECA+ZM或MRS1119分别与对照组比较**P（P）<0.01，CPA加DPCPX对比CPA；#P（P）<0.01，分别为NECA加DPCPX与对照或NECA；##P（P）<0.01，分别为NECA加MRS1706和NECA或NECA加DPCPX。
图6
图6。腺苷A1和A2B型受体调节AML-12细胞的核SREBP1、PPARα和PPARγ蛋白水平和转录活性。
用腺苷受体激动剂或拮抗剂或其组合（CPA，1μM；DPCPX，1μM；NECA，10μM；MRS1706，1μL）处理AML-12肝细胞，然后分离细胞核蛋白。通过Western blotting评估SREBP1、PPARα和PPARγ蛋白水平，并将其归一化为核蛋白P-84，用密度测定法定量蛋白质表达。(A类)核SREBP1、PPARα和PPARγ的Western blot。(B类)治疗12小时后的细胞核SREBP1蛋白水平。(C类)治疗1小时后核PPARα蛋白水平。(D类)治疗1小时后核PPARγ蛋白水平。(E类)治疗1小时后PPARα转录活性。(F类)治疗1小时后PPARγ转录活性。数据表示为4个独立实验的对照百分比（平均值±SD）*P（P）<0.01，与对照组或其他治疗组相比。
图7
图7。腺苷A1和A2B型受体调节参与脂肪酸合成和氧化的酶。
用腺苷受体激动剂或拮抗剂或其组合（CPA，1μM；DPCPX，1μM；NECA，10μM；MRS1706，1μL）处理AML-12肝细胞24小时，裂解细胞，通过Western blotting评估蛋白水平，通过密度计进行量化，并归一化为β-肌动蛋白。(A类)ACL、FAS、ACCα和CPTI的典型Western blot。(B类)ACL蛋白质水平。(C类)FAS蛋白水平。(D类)ACCα蛋白水平。(E类)CPTI蛋白质水平。数据表示为来自至少3个独立实验的控制百分比（平均值±SD）*P（P）<0.01，与对照组或其他治疗组相比。
图8
图8。腺苷A2B型受体调节AMPK的磷酸化，AMPK是控制肝脂肪酸氧化途径的关键信号分子，来自对照组或乙醇处理的WT和KO小鼠或腺苷a治疗的WT小鼠的肝组织1或A2B型收集受体拮抗剂，并如方法中所述分离蛋白质。
用腺苷受体激动剂或拮抗剂或其组合（CPA，1μM；DPCPX，1μM；NECA，10μM；MRS1706，1μL）处理AML-12肝细胞10分钟，裂解细胞并分离蛋白。通过Western blotting检测肝组织和培养肝细胞中的AMPK、磷酸化AMPK（PAMPK）水平，并通过密度计进行定量，计算PAMPK/AMPK/β-actin蛋白比率。(A类)肝组织中PAMPK、AMPK和β-肌动蛋白的蛋白质印迹。(B类)肝组织中PAMPK/AMPK/β-肌动蛋白比率(n个=每组5人）。(C类)培养肝细胞中PAMPK、AMPK和β-肌动蛋白的蛋白质印迹。(D类)培养肝细胞中PAMPK/AMPK/β-肌动蛋白比率。数据表示为至少3个体外对照组的百分比（平均值±SD）独立实验*P（P）<0.05，乙醇处理与对照**P（P）<0.05，分别用恩丙氨酸处理的小鼠和用载体或乙醇处理的WT小鼠；#P（P）<0.01，与对照组或其他治疗组相比。
图9
图9。乙醇诱导的腺苷释放通过腺苷A引发脂肪变化1和A2B型受体介导的刺激分别增加脂肪酸合成和减少脂肪酸利用。
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  • 腺苷激酶通过激活肝细胞中的自噬来保护对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤。
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