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.2009年6月18日；113(25):6411-8.
doi:10.1182/bloud-2008-07-170589。 Epub 2009年2月11日。

MicroRNA-29b通过直接靶向DNMT3A和3B以及间接靶向DNMT 1诱导急性髓细胞白血病中DNA低甲基化和抑癌基因再表达

拉米罗·加森 1, 刘淑君, 穆勒·法布里, 刘忠发, 凯瑟琳·E·A·赫阿菲, 伊丽莎·卡莱加里, 塞巴斯蒂安·施温德, 庞九霞, 余建华, 娜塔拉詹·穆图萨米, 维奥利安·阿维兰热, 斯特凡诺·沃利尼亚, 威廉·布鲁姆, 劳拉·J·拉什, 丹尼尔·佩罗蒂, 迈克尔·安德列夫, 克拉拉·德·布隆菲尔德, 约翰·C·伯德, 肯尼思·陈, 赖楚武, 卡洛·克罗斯, 吉多·马库奇
附属公司

MicroRNA-29b通过直接靶向DNMT3A和3B以及间接靶向DNMT 1诱导急性髓系白血病中DNA低甲基化和抑癌基因再表达

拉米罗·加森等。 血液. .

摘要

异常的DNA超甲基化通过沉默与造血相关的结构正常基因而促进髓系白血病的发生。MicroRNAs（miRNAs）是非编码RNA，通过靶向蛋白编码mRNAs来调节基因表达。最近，miRNAs已被证明在恶性细胞的基因超甲基化和沉默中作为靶点和效应器发挥作用。在当前的研究中，我们表明，在急性髓系白血病细胞中强制表达miR-29b导致DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在RNA和蛋白质水平上的表达显著降低。这反过来导致全球DNA甲基化减少，p15（INK4b）和ESR1通过启动子DNA低甲基化重新表达。虽然DNMT3A和DNMT3B的下调是miR-29b与这些基因的3'非翻译区直接相互作用的结果，但在DNMT1 3'非译区中未发现预测的miR-29b相互作用位点。进一步的实验表明，miR-29b通过靶向DNMT1基因的反式激活子Sp1间接下调DNMT1。总之，这些数据提供了miRNAs和急性髓系白血病异常DNA超甲基化之间的新功能联系，并表明合成miR-29b寡核苷酸作为有效的低甲基化化合物具有潜在的治疗用途。

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数字

图1
图1
miR-29b靶点DNMT1（DNMT1），DNMT3A型、和3B公司AML细胞系和原发性AML母细胞.（A）DNMT3A型，（B）DNMT3B公司、和（C）DNMT1型核穿孔（K562，MV4-11）或感染（Kasumi-1）后的mRNA表达-miR-29b型或其各自的对照（K562和MV4-11细胞的加扰寡核苷酸和Kasumi-1细胞的空载体慢病毒）。直方图显示与对照组相比，正常化后mRNA表达的折叠变化（减少）18秒在3个独立的实验中。条形代表SD。（D）DNMT1、DNMT3A和3B蛋白在预处理后的表达-miR-29b型或控制K562、MV4-11和Kasumi-1细胞系的核穿孔或感染。通过检测β-肌动蛋白抗体确认了等效的凝胶载量。（E）DNMT1（DNMT1）和DNMT3A型和3B公司原发性AML患者样本（n=3）中的mRNA表达-miR-29b型或者一个搅乱的寡核苷酸。直方图显示，与对照组相比，在与18秒。横线表示SD。
图2
图2
DNMT3A型和第3页是的目标miR-29b型.（A）2个萤火虫荧光素酶报告子构建的模式DNMT3A型和第3页，表示miR-29b型和的3′UTRDNMT3类（B）对与含有DNMT3A型或3B公司野生型或突变的3′UTR和pre-miR-29b型或如所指示的加扰的寡核苷酸。萤火虫荧光素酶活性归一化为Renilla荧光素酶活性。数据显示为前体的相对荧光素酶活性-miR-29b型对照转染细胞（扰乱寡核苷酸）共9个实验，来自3个独立转染。Bars代表SD。（C）对与含有DNMT1（DNMT1）3′UTR和pre-miR-29b型或打乱的寡核苷酸。数据显示为前体的相对荧光素酶活性-miR-29b型–转染细胞与从3个独立转染获得的9个实验的对照（扰乱寡核苷酸）有关。横线代表SD。
图3
图3
miR-29b靶点转速1（A）基因表达转速13′UTR，4个预测预-miR-29b型结合位点。下面是荧光素酶实验中使用的荧光素素酶报告分析的模式。红色方框上方的“X”标志表示miR-29b型已删除的网站。mut表示突变。（B） 对与含有野生型或突变体靶点的萤火虫荧光素酶构建物共转染的K562细胞进行双重荧光素酶检测转速1带预处理的3′UTR区域-miR-29b型或者一个搅乱的寡核苷酸。数据显示为前-miR-29b型-转染细胞与对照组（扰乱寡核苷酸）共9个实验，来自3个独立的转染。横线代表SD。（C）转速1前体细胞核穿孔（K562，MV4-11）或感染（Kasumi-1）后mRNA和蛋白表达-miR-29b型或它们各自的对照物、搅乱的寡核苷酸或空载体慢病毒。直方图显示了褶皱随SD的变化。（D）转速13例原发性AML患者前体细胞核穿后mRNA的表达-miR-29b型或打乱的寡核苷酸。直方图显示了与对照组相比，经标准化处理后的折叠变化（减少）18秒。横线表示SD。
图4
图4
DNMT1启动子活性被前体蛋白下调-miR-29b型通过镇压转速1.（A）第页的EMSADNMT1（DNMT1）转染K562细胞的启动子DNA和核提取物miR-29b型构造(miR-29b基因)或加扰控制（sc）。箭头表示DNMT1蛋白复合物。（B） EMSA的DNMT1（DNMT1）启动子DNA与人重组Sp1蛋白（0.5 mg，rhSp1，Promega，目录号E6391）或无蛋白提取物。这些数据进一步表明，Sp1与DNMT1（DNMT1）启动子DNA。（C） 第页，共页DNMT1（DNMT1）使用K562核提取物和未标记DNA竞争物的启动子DNA(转速1-绑定元素和DNMT1（DNMT1）启动子DNA，WT）。作为对照，我们使用了无DNA竞争对手（−）和包含TATA盒序列5′-GCAGAGCATAAGGTAGG a-3′的非特异性未标记探针（TFIID）。此序列与DNMT1（DNMT1）启动子DNA。这种寡核苷酸不竞争的事实表明DNA竞争的特异性DNMT1（DNMT1）DNA和SP1型DNA。（D） EMSA的DNMT1（DNMT1）启动子DNA使用K562核提取物和未标记野生型（WT）或突变体（M）过量（20倍）DNA竞争物。前两条车道（左起）没有竞争者。The sequences of theDNMT1（DNMT1）启动子DNA和各种DNMT1（DNMT1）具有链接器扫描突变的突变体（以粗体显示）如下所示（M1-M5）。
图5
图5
pre的过度表达-miR-29b型在AML细胞系中减少GDMMV4-11（A）和Kasumi-1（B）细胞系被核孔化（MV4-11）或感染（Kasumi-1）-miR-29b型（寡核苷酸和慢病毒）或其各自的对照。在核穿孔或感染72小时后从两种细胞系中获得DNA，并用LC-MS/MS测定GDM。用2.5μM的去甲基化剂或磷酸盐缓冲液（对照）处理MV4-11细胞系的结果也显示为阳性对照。数据显示为绝对GDM。条形图代表2个独立实验的范围。
图6
图6
预处理-miR-29b型恢复高甲基化的表达ESR1型和第15页墨水4b在MV4-11细胞系中（A）定量RT-PCRESR1型在K562和MV4-11细胞中（B），以及第15页墨水4b（C） 经过72小时的预处理-miR-29b型或打乱的寡核苷酸。直方图用SD表示平均值ESR1型K562（D）和MV4-11细胞（E）经预处理后的启动子区域-miR-29b型（■）或使用MassArray系统获得的打乱寡核苷酸（●）。连接点的线表示相应的CpG对。（F） DNA甲基化定量数据的散点图第15页墨水4b在MV4-11细胞中-miR-29b型（■）或打乱的寡核苷酸（●）。每个点代表一个CpG或一组分析的CpG。连接点的线表示相应的CpG对。散点图是使用GraphPad Prism（Windows 5.00版）创建的（GraphPad-Software，加利福尼亚州圣地亚哥）。这个P（P）获得了比较加扰和预处理之间CpG甲基化水平的值miR-29b型–使用配对Wilcoxon符号秩检验转染细胞。误差条指示SD。
图7
图7
pre的过度表达-miR-29b型诱导AML母细胞的部分分化（A）流式细胞术分析感染慢病毒表达的Kasumi-1细胞中CD11b的表达miR-29b型或空向量。绿色表示空矢量（EV）；红色，miR-29b型慢病毒。
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中的注释

  • MicroRNA：DNMT的mIR-ly调节因子？
    格里菲斯EA，戈尔SD。 Griffiths EA等人。 鲜血。2009年6月18日；113(25):6269-70. doi:10.1182/bloud-2009-03-210310。 鲜血。2009 PMID：19541832 没有可用的摘要。

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