Lin-28B transactivation is necessary for Myc-mediated let-7 repression and proliferation

doi:10.1073/pnas.0808300106

.2009年3月3日；106(9):3384-9.

doi:10.1073/pnas.0808300106。 Epub 2009年2月11日。

Lin-28B反式激活对Myc-介导的let-7抑制和增殖是必要的

宗成昌¹, 劳伦·泽特斯, 黄亨威, Raghu R Chivukula公司, 埃里克·文策尔, 迈克尔·杜斯, 贾森·荣格（Jason Jung）, Ping Gao公司, 池V当, 迈克尔A啤酒, 安德烈·托马斯·蒂霍连科（Andrei Thomas-Tikhonenko）, 约书亚·T·孟德尔

附属公司

PMID： 19211792
预防性维修识别码： PMC2651245型
内政部： 10.1073/pnas.0808300106

Lin-28B反式激活对Myc-介导的let-7抑制和增殖是必要的

宗成昌等。美国国家科学院程序. 2009.

.2009年3月3日；106(9):3384-9.

doi:10.1073/pnas.0808300106。 Epub 2009年2月11日。

作者

宗成昌¹, 劳伦·泽特斯, Hun-Way黄, Raghu R Chivukula公司, 埃里克·文策尔, 迈克尔·杜斯, 贾森·荣格（Jason Jung）, Ping Gao公司, 池V当, 迈克尔A啤酒, 安德烈·托马斯·蒂霍连科（Andrei Thomas-Tikhonenko）, 约书亚·T·孟德尔

附属

¹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院麦库西克·纳桑遗传医学研究所，邮编21205。

PMID： 19211792
预防性维修识别码： PMC2651245型
内政部： 10.1073/pnas.0808300106

摘要

致癌和抑癌网络对microRNA（miRNA）表达的直接控制会导致癌细胞中microRNA的频繁失调，并有助于肿瘤的发生。我们之前已经证明，c-Myc致癌转录因子（Myc）的激活广泛影响miRNA的表达，特别是导致miRNA的广泛下调。Myc抑制的miRNA转录物包括一些具有强大肿瘤抑制活性的转录物，如miR-15a/16-1、miR-34a和let-7家族成员。在本研究中，我们研究了Myc下游促进miRNA阻遏的机制。与转录下调一致，Myc活性导致多个miRNA初级转录物丰度降低。然而，令人惊讶的是，在高Myc状态下编码几个let-7 miRNAs的初级转录物并没有减少，这表明存在转录后抑制机制。最近证实，Lin-28和Lin-28B RNA结合蛋白对let-7的生物发生具有负调控作用。我们现在发现，Myc在多种人类和小鼠肿瘤模型中诱导Lin-28B表达。染色质免疫沉淀和报告分析显示Myc与Lin-28B启动子直接相关，导致转录转录激活。此外，我们证明激活Lin-28B对于Myc-介导的let-7阻遏是必要的和充分的。因此，Lin-28B功能的丧失显著损害Myc依赖性细胞增殖。这些发现突出了Lin-28B在Myc-driven细胞表型中的重要作用，揭示了Myc-mediated miRNA表达重编程中转录和转录后机制的协调。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
Myc对let-7表达的转录后抑制与Lin-28B诱导相关。(A类和B)前miRNAs丰度的qPCR分析(A类)和成熟let-7g(B)在Myc高或低表达的P493-6细胞中。(C)P493-6细胞中Lin-28和Lin-28B表达的RT-PCR分析。携带Lin-28或Lin-28B ORF的DNA质粒用作阳性对照的模板。(D类)P493-6细胞中Lin-28B表达的qPCR分析。(E类)去除tet后P493-6细胞中Lin-28B丰度的Western blot。在计算折叠变化之前，将信号标准化为α-微管蛋白水平。(F类)小鼠B细胞淋巴瘤中Lin-28B表达的qPCR分析。对来自MycON和MycOFF肿瘤的两个独立肿瘤进行了分析。(*G公司*)Ras转化p53全结肠癌中Lin-28B表达的qPCR分析。对来自Ras/Myc和Rasonly肿瘤的四个独立肿瘤进行了分析。对于所有qPCR分析，误差条表示来自3个独立测量的标准偏差。

**图2。**
*线-28B*是Myc的直接靶基因。(A类)转录起始位点附近基因组区域的示意图*线-28B*.显示假定的Myc结合位点（CACGTG或CATGTG）；红色的在人和鼠之间是保守的。该图描述了进化保护，由加州大学圣克鲁斯分校基因组浏览器生成（人类基因组2006年3月组装）。qPCR扩增子由编号的线表示。(B)Myc染色质免疫沉淀物的qPCR分析。折叠富集表示Myc免疫沉淀后获得的信号相对于无关抗体获得的信号。误差条表示从3个独立测量得出的标准偏差。(C)高或低Myc表达的P493-6细胞中启动子报告子结构的活性。显示的值表示每个报告者构造产生的相对萤火虫荧光素酶活性，标准化为海鳃共转染控制载体产生的荧光素酶活性。误差条表示从3个独立测量得出的标准偏差。荧光素酶上游的内部核糖体进入位点（IRES）被包括在这些载体中，因为在克隆的基因组片段中存在几个框架外翻译起始密码子。E、潜在Myc结合位点（E-box）。

**图3。**
Lin-28B基因敲除逆转let-7的抑制并减缓增殖。(A类和B)在没有tet（高Myc状态）的情况下培养P493-6细胞，并转染2种不同的靶向Lin-28B或阴性对照siRNA的siRNA。用qPCR检测Lin-28A(A类)或成熟let-7g丰度(B). (C)小干扰RNA传递后P493-6细胞的增殖。误差条表示三次转染测量的标准偏差。(D类)转染siRNA和miRNA抑制剂后P493-6细胞的增殖。误差条表示三次转染测量的标准偏差。*P（P）*通过双尾计算的值t吨测试。

**图4。**
强化Lin-28B表达完全重演了Myc-介导的let-7抑制，但对其他Myc-表达的miRNAs的影响有限。(A类)qPCR分析感染MSCV空株或MSCV-Lin-28B株的P493-6细胞中Lin-28A的表达。(B)逆转录病毒感染细胞中miRNA的Northern blot分析。我们使用了参考文献中描述的防止let-7家族成员之间杂交的条件。tRNA^赖氨酸用作装载控制。(C)通过微阵列分析比较Myc和Lin-28B表达的miRNA。由于交叉杂交，单个let-7家族成员在阵列上无法区分，因此被视为1组。(D类)miRNA微阵列结果的Northern杂交验证。(E类)与let-7种子区互补的基序在Lin-28B-up调控转录物的3′UTR中富集。显示了上调的3′UTR中相应基序的预期和观察到的计数。秩和百分位列表示与所有16384个可能的七聚体基序（虚线以上）或所有4096个可能的六聚体基模（虚线以下）相比，给定基序的相对丰富程度。(F类)通过微阵列分析比较Myc诱导和Lin-28B诱导的mRNA。具有多种类型干细胞特征的基因集在两种蛋白上调的转录物中富集。*P（P）*这些值由作为基因集富集分析工具集一部分的分子特征数据库计算得出(www.broad.mit.edu/gsea/msigdb/notnote.jsp)并且不针对多重假设检验进行校正。显示了每个基因集相对于所有测试的5452个基因集的富集等级。

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