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.2009年5月；136（5）：1732-1740.e3。
doi:10.1053/j.gastro.2009.01.069。 Epub 2009年2月6日。

大鼠前扣带皮层NR2B受体上调与内脏疼痛反应

京凡 1, 吴晓音 1, 曹志军 1, 陈圣良（Shengliang Chen） 1, 欧阳重 1, 李颖 2
附属公司

大鼠前扣带皮层NR2B受体上调与内脏疼痛反应

京凡等。 胃肠病学. 2009年5月.

缩回

摘要

背景和目标：电生理和行为研究表明，前扣带皮层（ACC）神经元N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体激活的增加在调节内脏超敏（VH）大鼠的内脏疼痛反应中起着关键作用。本研究旨在确定与促进内脏伤害感受有关的膝周ACC（pACC）神经元中NMDA受体亚型。

方法：我们对pACC神经元进行了体内电生理记录，并检测了正常和VH大鼠结肠过敏性结直肠扩张（CRD）的内脏运动反应（VMR）。将NR2A亚型受体拮抗剂[（R）-[（S）-1-（4-溴苯基）-乙胺基]-（2,3-二氧-1,2,3,4-四氢喹喔啉-5-基）-甲基]-膦酸（NVP-AAM077）和NR2B受体拮抗剂Ro25-6981微量注射到pACC中。为了下调NR2B受体基因的表达，通过电穿孔将NR2B特异性小干扰RNA（siRNA）和表达绿色荧光蛋白的质粒（pEGFP-N1）注入ACC神经元。

结果：反向微透析NVP-AAM077对VH组和对照组的基础和CRD诱导的ACC神经元放电没有影响。在VH大鼠中，Ro25-6981（500μmol/L）分别抑制了30和50 mm Hg CRD诱发的ACC神经元放电，抑制率分别为98%和52%。NVP-AAM077对两组的VMR均无影响。Ro25-6981显著抑制VH大鼠的VMR，但不抑制正常大鼠。免疫印迹分析显示在VH大鼠的pACC中NR2B受体表达增加。与对照组相比，NR2B siRNA处理的VH大鼠的VMR显著降低。

结论：NMDA受体的NR2B亚单位在调节VH大鼠ACC敏感性和内脏疼痛反应中起着关键作用。

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利益冲突声明

不存在利益冲突

数字

图1
图1。正常和VH大鼠输注NR2A或NR2B特异性拮抗剂时CRD兴奋的pACC神经元的尖峰放电率
结果分别来自正常大鼠和VH大鼠每组6个和9个CRD激发的pACC神经元。50毫米汞柱CRD而非30毫米汞柱的CRD诱发兴奋性反应。电针大鼠pACC神经元具有较高的自发活动。电针大鼠对30mm Hg CRD和50mm Hg CRD-诱发的pACC神经元反应的反应显著增加。(A类)NR2A拮抗剂NVP-AAM077以500μmol/L的剂量应用对正常和EA大鼠的基础（CRD 0 mm Hg）或CRD诱发的pACC神经元活动均无影响。(B)NR2B拮抗剂Ro25-6981以100μmol/L和500μmol/L的剂量给药对正常大鼠的基础或CRD诱发的pACC神经元活动均无影响。相反，Ro25-6981剂量依赖性（100μmol/L、500μmol/L和2 mmol/L）降低了电针大鼠基础pACC神经元放电，并抑制或消除了CRD诱发的pACC放电。这些观察结果表明，NMDA谷氨酸受体的NR2B亚型负责调节VH大鼠内脏伤害性刺激诱发的pACC神经元活动。数据以平均值±SEM表示*P（P）与0 mm Hg CRD相比<0.05(A类)与EA-vehicle相比(B).
图2
图2。注射NR2A或NR2B拮抗剂时VH大鼠CRD兴奋的pACC神经元的记录
在VH大鼠微透析载体（人工脑脊液）期间，结肠扩张（50 mm Hg）显著增加pACC神经元放电。(A类)微透析NR2A拮抗剂NVP-AAM077（500μmol/L）不会改变基础或CRD诱发的pACC神经元放电。(B)应用NR2B受体拮抗剂Ro25-6981（500μmol/L）显著降低基础pACC神经元活性，并抑制CRD诱导的pACC神经反应。(C,D类,E类,)神经生物素标记的pACC中神经元的显微照片。硫堇染色的冠状切片显示位于第II/II层的神经元的层流分布。(C′,D类′,E类′)高倍放大神经生物素标记的pACC神经元。比例尺：C、D、E、250μm；C′，D′E′，50μm。
图3
图3。双侧pACC注射选择性NMDA NR2B或NR2A受体拮抗剂对分级压力CRD诱导正常和VH大鼠VMR的影响
结果来自10只正常大鼠和12只电针大鼠。腹部肌肉收缩的平均幅度表示为基线减去后的曲线下面积（AUC）。(A类)将载体或NR2B拮抗剂Ro25-6981双侧微注射到pACC后，数据汇总表示为AUC。较高剂量（10mmol/L）的Ro25-6981对正常大鼠的VMR至CRD无影响；然而，它使EA大鼠的VMR显著降低到20、40和60毫米汞柱CRD。将低剂量Ro25-6981（1 mmol/L）注入pACC公司电针大鼠的肌肉收缩次数也显著减少。反应具有剂量依赖性。数据以平均值±SEM表示*P（P）与EA-vehicle相比，<0.05。(B)服用NR2A受体拮抗剂NVP-AAM077（10 mmol/L）不会改变正常或EA大鼠的自发肌肉收缩次数。数据以平均值±SEM表示*P（P）与正常车辆治疗大鼠相比，<0.05。
图4
图4。硫堇染色冠状切片的显微照片显示1只正常大鼠pACC的注射部位(A类)和2只VH大鼠(B,C)
比例尺：250μm。
图5
图5。正常和VH大鼠pACC中NMDA受体NR2A和NR2B亚型的表达
(A类,B,C)pACC的代表性免疫印迹显示NMDA受体亚单位NR1、NR2A、NR2B和肌动蛋白的表达，并显示大小（千道尔顿，kDa）。图中显示了一条控制车道和一条来自EA老鼠的车道。Western blot显示，内脏超敏反应诱导10天后，电针大鼠pACC中NR2B的表达水平显著增加，但NR1或NR2A的表达水平没有显著增加(C). (D类)通过密度分析测定免疫印迹中NMDA受体蛋白的相对强度。电针大鼠pACC中蛋白质表达的定量表示为对照组的百分比。每列代表平均值±SEM（每组3–5只大鼠）*P（P）<0.05，与对照组差异显著。
图6
图6。双侧微量输注对照siRNA或NR2B-siRNA的动物pACC蛋白匀浆的Western blot分析
(A类)显示了每组的代表车道。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）分离pACC蛋白，并将其转移到膜上。用NR2B抗体依次探测膜。NR2B-siRNA处理导致NR2B蛋白水平显著降低，而非靶向NR2B的蛋白水平没有变化。(B)用NR2B siRNA微量输注定量pACC中的蛋白质表达，以对照组的百分比表示。每列代表平均值±SEM（n=3/条件）**P（P）<0.01，与对照组差异显著。
图7
图7。电穿孔后3天pACC神经元中GFP和NR2B的免疫反应性
(澳大利亚)电穿孔后3天冠状切片显示GFP表达神经元。(抗体)更高倍镜下显示插入物的GFP表达澳大利亚.(交流)在TUNEL协同作用下，靶向pACC中很少有细胞发生凋亡。(文学士,Bb公司,密件抄送)对照siRNA和pEGFP-N1载体混合物的微量输注。(Bd公司,Be公司,Bf公司)微量输注pEGFP-N1载体和NR2B特异性siRNA的混合物。文学士和Bd公司显示对照组和siRNA-处理组pACC神经元中GFP染色的表达。Bb公司在对照大鼠中显示NB2B受体的免疫反应性。Be公司显示NR2B-siRNA治疗后pACC神经元中缺乏NR2B表达。密件抄送表达GFP和NR2B的pACC神经元（箭头）在合并图像中显示为黄色。(C,D类,E类)硫堇染色冠状切片的显微照片显示了3只大鼠的电穿孔部位。比例尺：澳大利亚，100微米；抗体和交流，10微米；钡–f，20微米；C,D类,E类，250微米。
图8
图8。双侧pACC注射NR2B特异性siRNA对分级压力CRD诱导正常和VH大鼠VMR的影响
(A类)原始肌电图显示，将NR2B特异性siRNA（1μg/μL）微量注射到正常大鼠（上面板）的pACC中，不会改变CRD引起的肌肉收缩次数。在VH大鼠（下面板）中，将NR2B特异性siRNA（1μg/μL）输注到pACC中可显著降低所有CRD压力（20、40、60 mm Hg）。(B)数据汇总表示为VMR响应CRD的AUC。结果来自15只正常大鼠和16只电针大鼠。NR2B siRNA注射对正常大鼠的VMR没有影响。在NR2B siRNA注射电针大鼠的pACC中，与对照siRNA注射电针的大鼠相比，VMR受到显著抑制。数据以平均值±SEM表示*P（P）与对照siRNA注射电针大鼠相比，<0.05。
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