Inducible mutant huntingtin expression in HN10 cells reproduces Huntington's disease-like neuronal dysfunction

doi:10.1186/1750-1326-4-11

.2009年2月9日4时11分。

doi:10.1186/1750-1326-4-11。

HN10细胞中亨廷顿蛋白的可诱导突变表达导致亨廷顿病样神经元功能障碍

安德烈亚斯·韦斯¹, 安娜·罗西奇, 保罗·帕加内蒂

附属公司

PMID： 19203385
预防性维修识别码： PMC2644693型
内政部： 10.1186/1750-1326-4-11

HN10细胞中亨廷顿蛋白的可诱导突变表达导致亨廷顿病样神经元功能障碍

安德烈亚斯·韦斯等。摩尔神经变性剂. 2009.

.2009年2月9日4时11分。

doi:10.1186/1750-1326-4-11。

作者

安德烈亚斯·韦斯¹, 安娜·罗西奇, 保罗·帕加内蒂

附属

¹瑞士巴塞尔诺华制药公司诺华生物医药研究所神经科学发现。paolo.paganetti@novartis.com。

PMID： 19203385
预防性维修识别码： PMC2644693型
内政部： 10.1186/1750-1326-4-11

摘要

背景：亨廷顿蛋白氨基末端聚谷氨酰胺重复序列的扩增可能是亨廷顿病的病因，亨廷顿氏病是一种致命的进行性常染色体显性神经退行性疾病，其特征是运动能力受损和严重的脑萎缩。扩展的聚谷氨酰胺重复序列改变了亨廷顿蛋白的构象，并在神经元中启动了一系列致病机制，包括细胞内亨廷顿蛋白聚集体、转录失调、能量代谢缺陷、突触营养不良以及最终的神经退行性变化。目前尚不清楚这些事件是如何相互关联的，也不清楚它们是否可以通过药物干预逆转。在这里，我们描述了表达正常和突变亨廷顿蛋白诱导片段的神经元细胞系。

结果：在HN10细胞中，野生型和突变型亨廷顿蛋白片段的表达依赖于诱导时间以及RhoSwitch（R）诱导配体的浓度。为了分析突变型亨廷顿蛋白表达对细胞功能的影响，我们将注意力集中在72Q第1外显子亨廷顿表达细胞系上，发现在诱导后，可以仔细解剖随着时间的推移而发展的突变型亨丁顿蛋白诱导的表型。突变体亨廷顿蛋白表达导致的转录失调表明，在动物模型和亨廷顿病患者中出现了转录特征复制。至关重要的是，突变体亨廷顿蛋白表达细胞中神经元分化的触发导致亨廷顿氏病额外病理特征的出现，包括细胞死亡。

结论：我们建立了野生型和突变型亨廷顿蛋白可诱导表达的神经元细胞系。这些新的细胞系代表了一个可靠的体外系统，用于亨廷顿氏病建模，并应广泛用于高通量筛选应用和研究突变亨廷顿蛋白的生物学。

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数字

图1
**野生型和突变型亨廷顿蛋白片段在克隆性HN10细胞系中的诱导表达**.A类：用于创建可诱导HN10细胞系的正常（25Q）和突变（72Q）Htt片段方案。B类：用500 nM RheoSwitch诱导Htt表达^®western blot分析显示，配体（RSL1）归一化了细胞裂解物中的微管蛋白含量。在非诱导细胞中未检测到基础表达。C类：在有或无诱导物的情况下处理的Htt细胞系的荧光免疫细胞化学显示诱导的Htt的表达。用500nM RSL1诱导五天导致Htt内含物的出现，特别是在72Q Htt-外显子1细胞的亚群中（白色箭头）。

图2
**72Q Htt-exon1的调控表达和聚集形成**.A类：向培养基中添加500nM RSL1诱导物导致在处理6小时后首次检测到的72Q Htt-外显子1表达的时间依赖性增加（生物三倍体的蛋白质印迹）。B类：从培养基中去除RSL1诱导物后，HN10细胞中72Q Htt-exon1的时间依赖性消失。C类：剂量依赖性Htt表达与25Q Htt-exon1、72Q Htt-exon1，25Q Htt-857和72Q Htt-857细胞系培养液中RSL1浓度的关系（western blot定量）。D类：72Q Htt-exon1细胞裂解物的AGERA印迹显示诱导Htt表达后Htt聚集物显著积聚，但在非诱导细胞中没有。E类细胞质和细胞核的亚细胞分离表明HN10细胞的细胞质中存在大量可溶性Htt。相反，在细胞核中检测到少量可溶性突变Htt和所有聚集的72Q Htt-exon1。

图3
**HN10细胞在增殖和分化条件下生长**调整培养条件可使HN10细胞分化为具有特征性神经元形态的细胞。用微管蛋白特异性抗体（红色通道）和Hoechst核标记物（蓝色通道）进行免疫细胞化学染色后，HN10细胞的典型相控显微照片和荧光图像。HN10细胞分化7天时可见密集的神经突起网络（bar=100μm）。

图4
**存在或不存在突变亨廷顿蛋白时增殖和分化HN10细胞的转录异常**.A类：通过实时PCR对表达和控制增殖的HN10细胞的突变体72Q Htt-外显子1中的选定基因组进行mRNA测定。B类：与A中相同，使用分化的非分裂HN10细胞。C类：HN10细胞分化对相同基因转录的影响。所有图表：n=3，*p<0.05*，**p<0.01，***p<0.001。

图5
**分化细胞72Q Htt-exon1表达导致顺乌头酸酶活性受损和caspase 3活性增加**.用500 nM RSL1诱导突变Htt表达后一天和两天细胞裂解液中乌头酶活性的测定(A类)和差异化(B类)72Q Htt-exon1细胞（白色条）与非受压细胞（黑色条）的比较。C类：在分化的HN10细胞（白色条）中用500 nM RSL1诱导72Q Htt-exon1表达后，细胞裂解液中caspase 3/7活性增加。野生型25Q Htt-exon1的表达降低caspase 3/7活性（黑色条）。所有图表：n=3，*p<0.05，**p<0.01。

图6
**变异亨廷顿蛋白在分化细胞中表达的毒性效应**.A类：在用500nM RSL1诱导野生型（黑条）和突变体（白条）Htt-外显子1后一天和两天，使用InCell Western测定分化的HN10系中微管蛋白与核的比率，定量作为细胞数量函数的轴突延伸。B类,C类：增殖中72Q Htt-exon1表达存在或不存在时的总细胞蛋白测定(B类)或差异化(C类)HN10细胞。所有图表：n=3，*p<0.05，**p<0.01。

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[1] Young AB、Shoulson I、Penney JB、Starosta-Rubinstein S、Gomez F、Travers H、Ramos-Arroyo MA、Snodgrass SR、Bonilla E、Moreno H等。委内瑞拉亨廷顿病：神经系统特征和功能衰退。神经病学。1986;36:244–249.-公共医学

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