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.2009年4月；83(8):3891-903.
doi:10.1128/JVI.01251-08。 Epub 2009年2月4日。

人类巨细胞病毒糖蛋白B是病毒进入和细胞间传播所必需的，但不是病毒粒子附着、组装或流出所必需的

玛丽莎·伊萨克森 1, 特蕾莎·康普顿
附属公司

人类巨细胞病毒糖蛋白B是病毒进入和细胞间传播所必需的，但不是病毒粒子附着、组装或流出所必需的

玛丽莎·K·艾萨克森等人。 J维罗尔. 2009年4月.

摘要

糖蛋白B（gB）同源物在疱疹病毒科中保守，似乎具有基本的普遍功能，以及特定疱疹病毒特有的特定功能。基因分析是分析蛋白质功能的有力工具，虽然有可能产生病毒突变体，但基本病毒敲除的互补性一直存在问题。人巨细胞病毒（HCMV）gB（UL55）在病毒的复制周期中起着重要作用。为了确定gB在HCMV感染中的功能，使用BAC系统生成重组病毒，其中UL55基因被galK（pAD/CreDeltaUL55）取代。病毒基因组中的UL55缺失以前就有过，表明UL55是一个重要基因。然而，如果不能成功弥补基因缺陷，就不可能对突变病毒进行表型分析。我们生成了表达HCMV gB的成纤维细胞，以补充pAD/CreDeltaUL55，并产生缺乏UL55基因但在病毒表面含有野生型gB的感染性病毒（DeltaUL55-gB HCMV）。这是HCMV突变体与糖蛋白缺失的首次成功互补。为了确定在没有gB的情况下DeltaUL55感染的特征，未完成细胞被DeltaUL55-gB病毒感染。检测所有阶段的基因表达，并将代表完整病毒的大量DNase抗性病毒DNA基因组释放到感染细胞上清液中。对这些病毒的梯度纯化表明，它们缺乏gB，但含有其他病毒结构蛋白。gB-null病毒与含有野生型gB-病毒的病毒一样能够附着在细胞表面，但在病毒进入和细胞间传播方面存在缺陷。然而，糖蛋白B阴性病毒确实含有感染性DNA，因为在用膜融合剂聚乙二醇处理附着的gB阴性病毒后，可以在成纤维细胞中检测到IE基因表达。综上所述，我们的结果表明，gB是病毒进入和病毒细胞间传播所必需的。然而，HCMV gB并非病毒附着或组装以及从受感染细胞流出的绝对必要条件。

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数字

图1。
图1。
重组HCMV UL55 gB基因替换为高尔克单位为pAD/Cre。（A） 加尔克使用引物对A（表1）对重组盒进行PCR扩增，将50bp的侧翼gB序列添加到高尔克基因。pAD/Cre的～2.7-kb UL55 gB基因通过重组被～1.2-kb取代高尔克基因，产生pAD/CreΔUL55。用氯霉素在含有半乳糖的中小型平板上筛选重组子。（B） 为了还原pAD/CreΔUL55，将2.7 kb野生型UL55重组盒重组到pAD/CreΔUL五十五中，生成pAD/CerΔUL55R。用氯霉素在含有脱氧半乳糖的最小-中等平板上筛选重组子。通过PCR（C）、EcoRI消化（D）和Southern印迹（E和F）确认所有BAC的正确重组。（C） PCR引物对C（表1）对应于UL56和UL55的3′端，在重组过程中未被替换，分别在pAD/Cre和pAD/CreΔUL55R或pAD/CerΔUL55中生成2.8或1.5 kb PCR片段。（D） 重组后UL55中EcoRI位点的丢失导致7.3kb片段（箭头）的消失，该片段在pAD/CreΔUL55R中恢复。UL55（E）或高尔克（F） 分别在pAD/Cre和pAD/CreΔUL55R或pAD/CerΔUL55中检测到这些基因（箭头）。
图2。
图2。
BAC质粒电穿孔成纤维细胞产生HCMV及其生长动力学分析。NHDF在没有BAC质粒（Mock）或带有pAD/Cre、pAD/CreΔUL55或pAD/CureΔUL55R的情况下电穿孔。电穿孔后14天，通过间接免疫荧光（A）检测IE基因表达，1周后，用结晶紫染色细胞以检测斑块形成（B）。在MOI为5（C）或0.01（D）的情况下，用pAD/Cre（⧫）或pAD/CreΔUL55R（○）电穿孔产生的病毒感染NHDF。去除含病毒的上清液，并用添加2%FBS的新鲜培养基替换。在感染后的零时间和不同时间，收集上清液并在NHDF上滴定。这些值表示一个实验中三种不同感染的平均值和标准偏差。
图3。
图3。
gB在NHDF中的表达和pAD/CreΔUL55的互补。（A） 用重组（-GFP或-gB）逆转录病毒转导NHDF后，收集细胞并用SDS-PAGE和HCMV AD169感染的细胞裂解物（HCMV裂解物）分析裂解物。将凝胶转移到硝化纤维素中，并使用抗体58-15进行免疫印迹以检测gB。（B） 将转导的细胞贴在盖玻片上，使用抗体27-78通过间接免疫荧光检测gB。（C） NHDF-GFP或NHDF-gB在没有BAC质粒或带有pAD/Cre或pAD/CreΔUL55的情况下电穿孔。电穿孔后约3周，细胞被结晶紫染色，以观察斑块形成。（D） 用BAC电穿孔上清液感染盖玻片上的NHDF，感染24 h后通过间接免疫荧光检测IE基因表达。（E） ΔUL55-gB病毒的单步生长曲线比较(▪) 在NHDF-gB上复制到HCMV回复病毒（•）。细胞以5.0的MOI感染。在感染后的不同时间，收集细胞和上清液，并用NHDF-gB或-GFP滴定。这些值表示一个实验中重复感染的平均值。
图4。
图4。
病毒粒子出口不需要HCMV gB。（A） 使用在NHDF-gB上传播产生并经山梨醇缓冲纯化的传染性AD169 HCMV或ΔUL55-gB病毒感染非补体NHDF。在感染后6天收集受感染的细胞裂解物，并通过免疫印迹分析，以检测单轮病毒复制期间IE、早期（UL44）和晚期（pp28）基因的表达。（B） NHDF-GFP或NHDF-gB被HCMV AD169或ΔUL55-gB模拟感染或感染，MOI为1 PFU/细胞。感染后6天，收集上清液并通过离心去除细胞碎片，上清液经过DNase I处理，HCMV DNA通过实时PCR定量，以确定感染后释放到上清液中的抗DNase基因组数量。误差条表示三个实验的标准偏差。（C） 将来自NHDF-GFP或NHDF-gBΔUL55-gB感染的受感染细胞上清液浓缩在20%山梨醇缓冲垫上，然后在20-70%山梨醇梯度中进行梯度纯化。提取病毒带，用Western免疫印迹法检测HCMV结构蛋白，包括gB、gH、pp150、pp71和pp28。
图5：。
图5：。
gB-null HCMV可以附着在细胞上，并含有感染性HCMV DNA。（A） 通过免疫印迹法分析来自等量纯化HCMV AD169和ΔUL55 gB病毒的gB。（B） 用AD169、ΔUL55-gB或ΔUL55 gB-null病毒或用可溶性肝素在4°C下预处理的病毒处理NHDF 1 h。用无血清DMEM洗涤细胞三次，收集细胞裂解液，提取DNA，并通过实时PCR定量病毒基因组。该图代表了三个类似实验中的一个。误差条表示一次实验中三份样品的标准偏差。（C） NHDF感染HCMV AD169、ΔUL55-gB或ΔUL55 gB-null病毒。去除上清液，并用无血清DMEM或含有PEG浓度降低（50、25和12.5%）的无血清DMEM清洗细胞三次。将添加有2%FBS的DMEM添加回细胞，感染后24 h，用间接免疫荧光法检测IE基因的表达。
图6。
图6。
细胞间传播需要gB。NHDF-GFP或NHDF-gB感染HCMVΔUL55-gB病毒稀释液。取出病毒接种物，用plaquing培养基覆盖细胞。感染后约3周，细胞被结晶紫染色，以观察斑块形成。
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