Toll-like receptor 4 mediates synergism between alcohol and HCV in hepatic oncogenesis involving stem cell marker Nanog

doi:10.1073/pnas.0807390106

.2009年2月3日；106(5):1548-53.

doi:10.1073/pnas.0807390106。 Epub 2009年1月26日。

Toll样受体4介导酒精和HCV在肝肿瘤发生中的协同作用，涉及干细胞标志物Nanog

凯戈·马奇达¹, 冢本秀一（Hidekazu Tsukamoto）, 哈斯米克·姆克钦, 段乐伟, 阿拉·戴尼克, 刘敏仪（Helene Minyi Liu）, 金鸡细辛, 苏甘塔·戈文达拉扬, 拉特纳·雷, Ou Jing-Hsiung James, Ekihiro Seki先生, 雷蒙德·德斯海斯, 三宅贤介, 迈克尔·M·C·赖

附属公司

PMID： 19171902
预防性维修识别码：项目经理2635765
内政部： 10.1073/pnas.0807390106

Toll样受体4介导酒精和丙型肝炎病毒在肝肿瘤发生中的协同作用，涉及干细胞标记物Nanog

凯戈·马奇达等。美国国家科学院程序. 2009.

.2009年2月3日；106(5):1548-53.

doi:10.1073/pnas.0807390106。 Epub 2009年1月26日。

作者

凯戈·马奇达¹, 冢本秀一（Hidekazu Tsukamoto）, 哈斯米克·姆克钦, 段乐伟, 阿拉·戴尼克, 刘敏仪（Helene Minyi Liu）, 金鸡细辛, 苏甘塔·戈文达拉扬, 拉特纳·雷, Ou Jing-Hsiung James, Ekihiro Seki先生, 雷蒙德·德沙伊斯, 三宅贤介, 迈克尔·M·C·赖

附属

¹南加州酒精、肝脏、胰腺疾病和肝硬化研究中心，南加州大学凯克医学院分子微生物学系，2011年，洛杉矶，加利福尼亚州90033，美国。

PMID： 19171902
预防性维修识别码：项目经理2635765
内政部： 10.1073/第0807390106页

摘要

酒精可以协同增强肝脏疾病的进展以及丙型肝炎病毒（HCV）导致肝癌的风险。然而，这种协同作用的分子机制尚不清楚。在这里，我们首次证明了Toll样受体4（TLR4）是由HCV非结构蛋白NS5A的肝细胞特异性转基因（Tg）表达诱导的，这种诱导通过酒精诱导内毒素血症介导协同性肝损伤和肿瘤形成。我们还确定Nanog（干/祖细胞标记物）是一种新的下游基因，通过TLR4激活和酒精喂养的NS5A-Tg小鼠肝肿瘤中CD133/Nanog阳性细胞的存在而上调。移植用TLR4转导的p53缺失的肝祖细胞会导致重复注射LPS的小鼠发生肝癌，但伴随的Nanog短发夹RNA转导会消除这种结果。综上所述，我们的研究证明了HCV和酒精协同肝脏疾病的TLR4依赖性机制，以及TLR4下游基因Nanog在酒精增强HCV诱导的肝癌发生中的强制性作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
NS5A转基因小鼠对内毒素挑战的敏感性增加。(A类和B类)如RT-PCR所示，NS5A-Tg小鼠肝脏中TLR4 mRNA和蛋白表达增加(A类)和Western印迹(B类)分析。(C类)LPS激发24小时后（25 mg/kg体重，腹腔注射）收集的肝脏H&E染色切片显示NS5A-Tg小鼠出现凝固性坏死伴出血(中部)但野生型小鼠（WT，顶部)或TLR4缺乏的NS5A Tg小鼠（TLR4^−/−NS5A，底部)（放大倍数：100倍）。(D类)LPS激发24小时后血清AST水平。TLR4缺乏（TLR4^−/−)与野生型小鼠（WT；*，*P（P）*< 0.05). NS5A-Tg小鼠与WT相比显示出增加的AST升高（*，*P（P）*<0.05），TLR4缺乏（TLR4^−/−NS5A）（*，*P（P）*< 0.05). (E类)注射LPS后血清TNF-α水平的时程变化。Tlr4降低了WT中增加的TNF-α水平^−/−(*,*P（P）*<0.05），但在NS5A小鼠中增加（**，*P（P）*< 0.05). 在Tlr4中消除NS5A小鼠中升高的TNF-α水平^−/−NS5A（***，*P（P）*< 0.05). (F类)LPS诱导的信号，如TAK1与TRAF6或IRAK的相互作用在NS5A中增强，但在Tlr4中没有增强^−/−NS5A小鼠。(*G公司*)NS5A中LPS诱导的肝脏JNK和IκBα磷酸化增加，而Tlr4没有增加^−/−NS5A小鼠。

**图2。**
如这张代表性照片所示，HCV NS5A在12个月的酒精喂养后诱发肝肿瘤(左侧)肝脏外观和显微照片(赖特)肿瘤的H&E染色切片。（放大倍数：100倍）。

**图3。**
(A类)共聚焦免疫荧光显微镜显示，喂食酒精12个月的NS5A小鼠的肿瘤组织中，干细胞标记物Nanog与CD133或CD49f共定位。（放大倍数：100×。）(B类)通过免疫印迹分析测定，在喂食酒精的NS5A小鼠的肝脏中诱导了纳米蛋白。β-肌动蛋白的免疫印迹作为负荷控制。(C类)根据实时PCR（*，*P（P）*与乙醇喂养的WT小鼠相比<0.03）。这种诱导作用在以乙醇为燃料的Tlr4中减弱^−/−NS5A小鼠（*，*P（P）*与乙醇燃料NS5A相比<0.03）。(D类)LPS在NS5A表达载体（*，*P（P）*与用空载体和对照shRNA转导的细胞相比<0.002）。这种诱导被TLR4的shRNA的逆转录病毒表达抑制（**，*P（P）*< 0.05). LPS处理也能在用表达野生型TLR4（TLR4+，*，*P（P）*与对照细胞相比<0.05），但在用突变TLR4载体（TLR4ΔCyp）转导的细胞中没有。(E类)在免疫印迹分析和密度分析中，逆转录病毒shRNA载体有效地击倒TLR4，显示减少了82%（*，*P（P）*< 0.05). (F类)添加到培养物中的LPS激活了转染启动子荧光素酶结构体的Huh7细胞中的Nanog启动子（*，*P（P）*与对照细胞相比<0.002）。如上所述，用shRNA敲除TLR4，使启动子激活失效（**，*P（P）*< 0.05). 野生型TLR4（TLR4+，*，*P（P）*<0.05），但突变TLR4（TLR4ΔCyp）未赋予细胞LPS诱导的Nanog启动子激活。相对光单位值通过*雷尼利亚*由SV40启动子驱动的荧光素酶构建体作为转染对照。

**图4。**
成肝细胞移植导致肝肿瘤的TLR4依赖性发展。(A类)在纯化的E-cadherin中逆转录病毒转导TLR4后产生肝肿瘤的示意图⁺来自*第53页*^−/−小鼠，将成肝细胞移植和植入受体C57BL/6小鼠，以及重复注射LPS。(B类)移植后肝脏的大体照片*第53页*^−/−用c-Myc、Tlr4、Nanog、shRNA转导的成肝细胞（用于Nanog）或打乱的shRNA和25周的LPS治疗（每隔一天腹腔注射2 mg/kg，c-Myc转导细胞的小鼠未接受LPS）。(C类)移植后受体小鼠的肿瘤发生率*第53页*^−/−用所示基因和/或shRNA转导的成肝细胞*第53页*^−/−c-Myc转导的细胞大多在未经LPS治疗的情况下发生肝肿瘤。接受TLR4转导的小鼠移植*第53页*^−/−细胞也以40%的发病率发展为肝肿瘤(**P（P）*< 0.03). 这种肿瘤发病率通过Nanog shRNA的共转导而受到抑制，但不控制干扰的shRNA（**，*P（P）*与对照shRNA转导的细胞相比<0.05）。在不注射LPS的情况下转染Nanog也会产生肝肿瘤，但频率要低得多（***，*P（P）*与无LPS的空载体转导细胞相比，<0.05）。(D类)LPS治疗小鼠移植瘤肝的GFP显像*第53页*^−/−用TLR4加Nanog shRNA或对照shRNA转导的成肝细胞(E类)转基因细胞移植后小鼠存活曲线(F类)通过裸鼠在皮下移植后不同时间的三维GFP成像进行肿瘤体积测量*第53页*^−/−用TLR4（TLR4胞质结构域（ΔCyt）或c-Myc的缺失突变体）转导的成肝细胞。请注意，即使没有LPS治疗作为阳性对照，c-Myc转导的细胞也能进行肿瘤生长。在接受TLR4转导细胞移植的小鼠中，由于重复注射LPS而导致肝肿瘤发生并生长，但没有注射LPS。用突变TLR4转导的细胞未能形成肿瘤块，*P（P）*与含有LPS的空载体转导细胞相比，<0.05。）(*G公司*)成肝细胞(*第53页*^−/−)用Nanog或对照逆转录病毒转导后，将其皮下移植到裸鼠体内，并如上所述监测肿瘤的质量生长。在感染后10天和移植前对转导的细胞进行免疫印迹分析。该分析证实了Nanog的表达(插入). 与用控制载体（*，*P（P）*< 0.05). (*H（H）*)表达TLR4的肝祖细胞在反复注射LPS的裸鼠体内引起肿瘤生长，并且这种生长被Nanog shRNA（*，*P（P）*< 0.04). 移植后10天收集的成肝细胞裂解物的免疫印迹和LPS注射证实了TLR4转导细胞中Nanog的诱导以及通过共同转导特异性shRNA有效地击倒Nanog(插入).

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