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.2009年3月4日；27(10):1530-9.
doi:10.1016/j.vaccine.2009.01.009。 Epub 2009年1月23日。

为有效免疫人类新城疫病毒载体疫苗，需要将疫苗输送到下呼吸道

约书亚·M·迪那波利 1, 杰罗尔德·M·沃德, 郑莉莉, 杨丽娟, 苏比亚·埃兰库马兰, 布莱恩·墨菲, 锡巴K萨马尔, 彼得·柯林斯, 亚历山大·巴克利耶夫
附属公司

为有效免疫人类新城疫病毒载体疫苗，需要将疫苗输送到下呼吸道

约书亚·M·迪那波利等。 疫苗. .

摘要

新城疫病毒（NDV）是一种禽病毒，目前正在评估开发针对新出现病原体的载体人类疫苗。以前在小鼠模型中对新城疫病毒载体疫苗的研究表明，通过注射或鼻内途径接种后，疫苗具有效力。我们在一个非人类灵长类动物模型中比较了NDV载体疫苗的各种输送途径的效力。虽然通过鼻内/气管内联合途径接种NDV载体疫苗可引起保护性免疫反应，但仅通过皮下途径或鼻内途径接种可引起有限或无保护性免疫应答，这表明有必要将疫苗接种到下呼吸道。此外，将基于NDV中基因株（NDV-BC）的疫苗与基于携带多碱基F裂解位点（NDV-VF）的改良lentogenic株（NDV VF）设计的类似NDV载体进行直接比较，表明这两个NDV株的免疫原性相似，具有同等的保护性。

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数字

图1
图1
用NDV-BC/HN对AGM进行SC或IN/IT免疫后的血清抗体反应。（A）NDV-特异性和（B）HPIV3 HN特异性猴血清抗体反应，是通过SC或IN/IT途径输送一或两剂指示的病毒。平均对数2各组显示滴度±SE。虚线表示检测极限（2 log2). 低于检测极限的滴定液的值为1 log2用于计算平均值和SE。每组包含4只动物。
图2
图2
用NDV-BC、NDV-BC/S或NDV-VF/S对AGM进行IN或IN/IT免疫后，NDV载体脱落。在第0天给药指定的NDV构建物后的第2、4和6天采集TL样本。通过DF-1细胞单层上的斑块滴定法测定每个样品中的NDV滴度。绘制每只动物的个体值（NDV-BC对照组包含2只动物；其他组每个包含4只动物），组平均值用横线表示。虚线表示检测极限（0.4 log10PFU/ml）。低于检测极限的值指定为0.2 log10PFU/ml。该实验在图3、图4、图5、图6和表1中继续进行。
图3
图3
在第0天和第28天用NDV-BC、NDV-BC/S或NDV-VF/S（A）NDV-特异性HAI血清抗体应答对AGM进行IN或IN/IT免疫后的血清和粘膜抗体应答；各组的平均滴度±SE。值低于检测极限（2 log2，虚线）被赋值为1 log2用于计算。（B） 以纯化的SARS-CoV S为抗原，ELISA评价SARS-CoV-特异性血清IgG反应；各组相对于第0天±SE的平均倍数增加。每只动物的数值记录为日志2在450nm处产生的吸光度是背景值的两倍以上，大于0.3。低于检测极限的值被赋值为2 log2.在第0天，平均背景日志2各组滴度如下：NDV-BC IN/IT，2.0；NDV-BC/S IN/IT，4.3；NDV-VF/S输入/输出，4.8，NDV-BC/S输入，2.5。P（P）与NDV-BC IN/IT（对照）组在相同时间点的值相比，使用Bonferroni事后分析的重复测量双向ANOVA计算值：*P（P）<0.01。（C） SARS-CoV中和血清抗体反应；平均对数2各组滴度±SE。值低于检测极限（2 log2，虚线）被赋值为1 log2.P（P）使用重复测量的双向方差分析和Bonferroni事后分析计算值，并与NDV-BC IN/IT（对照）组在同一时间点的值进行比较：*P（P） < 0.01; **P（P） < 0.001. 注：未在第21天和第49天测定NDV-BC IN/IT组的滴度。在这些时间点P（P）使用NDV-BC IN/IT组的第0天值计算其他组的值。（D） SARS-CoV特异性粘膜IgA反应；各组相对于第0天的平均增加±SE倍。收集TL样品并浓缩20-30倍。然后以1:10（3.3 log2). 每只动物的数值记录为日志2在450nm处产生的吸光度是背景值的两倍以上，大于0.1。低于检测极限的值被赋值为2.3 log2为了解释样品采集和浓度的变化，然后将滴度归一化为每个样品中的总IgA质量，如总IgA-ELISA定量测定结果所示。在第0天，平均归一化对数2各组背景滴度如下：NDV-BC IN/IT，1.7；NDV-BC/S IN/IT，1.8；NDV-VF/S输入/输出，2.0，NDV-BC/S输入，1.7。
图4
图4
SARS-CoV利用NDV-BC、NDV-BC/S或NDV-VF/S在第0天和第28天通过in或in/IT途径免疫的动物体内挑战病毒复制：SARS-CoV在呼吸道分泌物中脱落。在第56天用SARS-CoV攻击动物，在攻击后第1天和第2天收集NW和TL样本，并通过Vero细胞中的病毒滴定进行分析。平均对数10显示了各组的滴度±SE。检测极限（1 log10TCID公司50/ml）用虚线表示；低于限值的样本被赋值为0.5 log10显示平均值±SE值。P（P）通过使用重复测量的双向方差分析和Bonferroni事后分析，比较实验组和对照组的平均滴度，计算数值：*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.
图5
图5
在第0天和第28天通过in或in/IT途径用NDV/BC、NDV-BC/S或NDV-VF/S免疫的动物中，SARS-CoV挑战病毒复制：呼吸道组织样本中SARS-CoV挑战病毒的直接定量（这是图4所示实验的继续）。这些动物在第56天接受SARS-CoV的挑战。然后在激发后第2天对他们实施安乐死，并从指定区域采集组织样本。对每只动物的重复组织样本进行均质化，并测定病毒滴度。平均对数10显示了各组的滴度±SE。检测极限（2 log10)用虚线表示；低于限度的滴度值为1.5 log10TCID公司50/g、。显示了平均值±SE值。P（P）通过使用重复测量的双向方差分析和Bonferroni事后分析，比较实验组和对照组的平均滴度，计算数值：*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001.
图6
图6
在第0天和第28天通过IN或IN/IT途径用NDV-BC或NDV-BC/S免疫的动物的SARS-CoV挑战：IHC和在第56天用SARS-CoV挑战后2天采集的肺组织的组织病理学分析（这是图4、图5所示实验的继续）。所有显微照片均以400倍放大率拍摄。顶行：SARS-CoV N蛋白（S）的IHC检测。在病媒控制组（左侧面板）中可以看到大量抗原阳性细胞，但在通过in/IT途径免疫NDV-BC/S的动物中没有看到抗原阳性细胞（右侧面板）。通过in途径免疫NDV-BC/S的动物中也存在抗原阳性细胞，尽管数量有所减少（中间面板）。最下面一行：苏木精和伊红染色。在通过in途径（中图）用空载体（左图）或NDV-BC/S免疫的动物中观察到SARS-CoV发病的特征，包括主要由中性粒细胞和淋巴细胞引起的间质和衬里上皮的显著细胞浸润（I）。此外，以前用NDV-BC/S In/IT免疫的动物中明显存在的纤毛（C）（右图）在用空载体或NDV-BC-S In免疫的动物体内基本上不存在。总的来说，通过In/IT途径免疫NDV-BC/S的动物中未观察到明显的病理变化（右图），而通过IN途径（中间）免疫NDV-BC/S的动物，其病理变化与空载体对照动物（左侧）的病理变化相似。
图7
图7
温度对NDV-BC菌斑形成的影响。用NDV-BC（A和B）或HPIV3（C）的系列稀释液感染DF-1（A）和LLC-MK2（B和C）细胞的单层，并在所示温度下在甲基纤维素中培养4（A部分）、10（B部分）和12（C部分）天。单层固定并用结晶紫（DF-1细胞）染色，用抗NDV抗体（NDV，LLC-MK2细胞）免疫染色，或用抗HPIV3抗体（HPIV3）免疫染色。使用Adobe Photoshop CS2 Extended软件测量牙菌斑大小。显示了基于每种温度下每种病毒10个斑块的平均斑块大小（像素）±SE。
图8
图8
在32和39°C下，在5 PFU/细胞（A）或0.001 PFU/细胞（B）的MOI感染的LLC-MK2细胞中，NDV-BC、NDV-BC/S和HPIV3的生长动力学。LLC-MK2细胞的三硅酸盐单层在所指示的MOI下被感染，并且存在于上清液中的病毒在感染后的不同时间点被滴度。滴度记录为对数10PFU/ml±标准误差。
图9
图9
感染LLC-MK2细胞中NDV抗原的表达：（A）感染NDV-BC或NDV-BC/S后24小时，在32°C或39°C的温度下培养，MOI为5 PFU，或（B和C）感染NDV BC（B）或NDV BC/S（C）后24、48、72和96小时，在MOI为0.001 PFU的温度下孵育。在感染后的指定时间点制备细胞裂解物，并使用NDV特异性抗体和β-肌动蛋白特异性抗体进行SDS-PAGE/Western blot分析。HPI:h感染后。
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