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.2009年1月；16(1):58-69.
doi:10.1016/j.devcel.2008.11.008。

FGF对Hey2的调节为维持Corti器官中柱细胞命运提供了Notch依赖性机制

安吉丽卡·多兹霍夫（Angelika Doetzlhofer） 1, 马丁·巴施, 大山高弘, 曼弗雷德·盖斯勒, 安德鲁·克格罗夫斯, 尼尔·塞吉尔
附属公司

FGF对Hey2的调节为维持Corti器官中柱细胞命运提供了Notch依赖性机制

安吉丽卡·多兹霍夫（Angelika Doetzlhofer）等。 开发人员单元格. 2009年1月.

摘要

科尔蒂器官是内耳的听觉器官，包含两种感觉毛细胞和至少七种支持细胞。大多数支持细胞类型依赖于Hes/Hey转录因子的Notch依赖性表达来维持支持细胞的命运。这里，我们表明Notch信号对柱细胞命运的分化和维持不是必需的，柱细胞通过Hey2表达来区分，并且与其他Hes/Hey因子一样，Hey2的表达是Notch独立的。Hey2被FGF激活并阻止毛细胞分化，而Hey2突变使支柱细胞对Notch信号的丢失敏感，并允许它们分化为毛细胞。我们推测，FGF信号的协同作用使Hey2 Notch独立，也使柱细胞摆脱了与周围毛细胞直接接触的需要，并使内耳复杂细胞镶嵌的进化重塑成为可能。

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数字

图1
图1。γ-分泌酶抑制剂DAPT诱导毛细胞异位移植治疗新生儿Corti器官
A： 出生后第0天Corti器官示意图（P0）。内（ihc）和外（ohc）毛细胞（绿核）被支持细胞亚型包围：内指骨细胞（i）、内外柱细胞（p）、Deiters细胞（d）和Hensen细胞（h）。B： Corti的新生儿Math1/GFP转基因器官的整体数量。Math1/GFP表达式标记毛细胞（绿色）。C： 新生儿耳蜗器官培养物对DAPT反应的异位毛细胞产生的时间过程。箭头标记内部毛细胞，括号标记外部毛细胞（Math1/GFP，绿色）。D： C的定量。在两种独立的制剂中获得了类似的结果（误差bar±s.e.m.）。E： DAPT中的异位Math1/GFP+细胞（绿色）表达肌球蛋白VI（红色）。F： 在对照或DAPT处理的耳蜗器官中的Math1/GFP+毛细胞（绿色）中未观察到BrdU掺入（红色）。耳蜗器官的间充质层（取自感觉上皮基膜下的共焦平面）用作BrdU染色对照。比例尺：A中0.5mm；C、E、F中为50μm。
图2
图2。在没有Notch信号的情况下，Deiters细胞（而非柱细胞）转分化为毛细胞
A–D:P0 Math1/GFP转基因耳蜗外植体在DAPT或DMSO存在下培养72小时（对照）。A： DAPT中的异位毛细胞（绿色）伴随着Deiters细胞区域（白色括号）中Prox1+细胞（红色）的丢失。B–C：72小时后，使用和不使用DAPT治疗的Math1/GFP+毛细胞（B）和Prox1+支持细胞（C）的量化。耳蜗中尖区和中基底区的Math1/GFP+毛细胞和Prox1+支持细胞的数量标准化为100μm（n=5；误差条±标准误差）。D： 柱细胞在无Notch信号的情况下持续存在：p75抗体染色（红色）标记对照组（DMSO处理）和DAPT处理耳蜗外植体（黄色箭头）中的柱细胞。E-：柱细胞维持在Corti的P0 Notch1突变器官中：磷脂染色（绿色）标记富含肌动蛋白的毛细胞束（静纤毛）。p75抗体染色（红色）标记柱细胞顶端（黄色箭头）。F： Corti RBP-J突变器官中的支柱细胞分化不受影响。E13 RBP-J突变体和野生型耳蜗外植体培养4天。p75抗体染色标记柱细胞（红色、黄色箭头）。Parvalbumin染色标记内部（绿色，箭头）和外部毛细胞（绿色，括号）。比例尺：A、D、E、F中为50μm。
图3
图3。Notch信号对支柱细胞中Hey2的表达不是必需的
A： Hes5、Hey1、Hey2和HeyL转录物以及Hes1/GFP转基因在Corti新生儿器官（P0-P2）中的表达。用肌球蛋白VI染色法（红色）观察毛细胞。箭头指向内部毛细胞，括号标记外部毛细胞。两个括号指向柱细胞（p）和Deiters细胞（d）的细胞核（蓝色）；箭头指向Hensen（h）和内指骨细胞（iph）。大括号标记Köllikers器官（ko）。B： Corti器官示意图，显示Hes和Hey基因表达模式的组织。C： DAPT存在时，Hey2和Hes1 mRNA水平不变。P1期耳蜗器官Math1和Hey2、Hes1、HeyL、Hey1、Hes5 mRNA的相对表达水平（QPCR），分别暴露于8h DAPT（灰色条）、22h DACT（白色条）和22h DMSO载体对照（黑色条；n=3；误差条±s.e.m.）。D： 在没有Notch信号的情况下，Hey2蛋白在支柱细胞中保持表达。Math1/GFP转基因P1耳蜗器官在DAPT或DMSO（对照）存在下培养48小时，并用Hey2抗体（红色）染色。Math1/GFP表达（绿色）标记内部毛细胞（白色箭头）和外部毛细胞（白色括号）。黄色箭头表示柱状细胞。*Hey2抗体与细胞外基质的非特异性结合。比例尺：A、D中的50μm。
图4
图4。Hey2需要在没有Notch信号的情况下维持柱细胞的命运
A–C:P0 Math1/GFP+野生型和突变型Hey2（Hey2−/−)耳蜗外植体在DAPT或DMSO（对照）中培养72小时。A： DAPT处理的Hey2−/−耳蜗外植体显著减少了柱细胞区（黄色括号）中Prox1+细胞（红色）的数量，而Deiters细胞区（白色括号）中没有Prox1+的细胞。B： 柱细胞特异性p75染色（红色、黄色箭头）证实DAPT中Hey2−/−耳蜗移植物中柱细胞严重缺失。C： 对照野生型和Hey2突变培养物（黑条）和DAPT处理培养物（红条）中Prox1+细胞/100μm的定量。对于每种情况，分析三个独立实验中的至少三个耳蜗培养物（误差线±标准误差）。比例尺：A、B中为50μm。
图5
图5。FGF和Notch信号阻止柱细胞转分化为毛细胞
A： 抑制Notch和FGF信号转导导致支柱细胞特异性Hey2蛋白表达（红色）的丢失和阴茎倍体蛋白的增加+毛细胞（绿色）。P0耳蜗移植物在DMSO（对照）中培养48小时或在FGF抑制剂SU5402、DAPT或两者的存在下培养48小时后，用Hey2抗体（红色）和指骨蛋白（绿色）染色。注：如前所述（Kiernan等人，2005年），Notch信号的丢失导致了指骨素标记的毛细胞束的紊乱（DAPT，DAPT+SU5402，绿色）（见图2E）。B： 在DAPT和SU5402（红条）中培养耳蜗外植体22小时，导致Hey2 mRNA水平显著降低。条形图表示三个独立实验的平均值（误差条形图±标准误差）（*<0.01）。C： P0 Math1/GFP转基因耳蜗外植体在有无DAPT和SU5402培养72小时后，用Prox1抗体（红色）染色。D： 对C区Prox1+细胞进行定量。对每种情况下至少三次耳蜗培养进行分析（误差线±标准偏差）。比例尺：A、C中为50μm。
图6
图6。FGF17上调Hey2可在无Notch信号的情况下阻止Deiters细胞转化
A–C:P0耳蜗外植体在FGF17存在下培养48小时。A–B：在存在FGF17的情况下柱细胞特异性p75和Hey2表达的扩增。C： FGF17存在时Hey2 mRNA表达上调。条形图表示三个独立实验的平均值（误差条形图±标准误差）。D： FGF17在没有Notch信号的情况下阻止Deiters细胞的转分化。E： D中Prox1+细胞的定量。对每种情况下的三种耳蜗培养物进行分析，黑色条代表Prox1+cell/100μm的平均值（误差条±标准误差）。F： FGF17不阻断Hey2突变耳蜗移植体中DAPT的作用。G： F中Prox1+细胞的定量。对每种情况下至少三次耳蜗培养进行分析（误差线±标准偏差）。顶部面板（A、B、D、F）：Math1/GFP（绿色）标签内部（箭头）和外部（括号）毛细胞。中间面板显示p75（A）、Hey2（B）和Prox1（D，F）抗体染色为红色。黄色括号标记柱状细胞结构域，白色括号标记Deiters细胞结构域。比例尺：A、B、D、F中为50μm。
图7
图7。FGF和Notch信号传导冗余作用，防止柱状细胞转分化为毛细胞
A： 信号图表示FGF和Notch对Math1表达和支柱细胞表型维持的影响。Math1对于内耳毛细胞分化来说既是必要的也是充分的（Bermingham et al.，1999；Zheng and Gao，2000），Hey2或Hes5都可以抑制Math1的表达，从而阻止柱细胞转分化为毛细胞。B： Hey2在FGF信号的控制下表达，并且在很大程度上独立于Notch信号的变化。C： 在没有Hey2的情况下，Hes5在柱状细胞中上调（见图S5），导致持续的Notch依赖性阻滞转分化，这表明Hey2通常抑制Hes5的表达。D： 如果FGF和Notch信号均被阻断，则Hey2和Hes5均未表达，从而导致Math1去表达和柱细胞转分化为毛细胞。
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