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.2009年2月18日；28(4):347-58.
doi:10.1038/emboj.2008.294。 Epub 2009年1月15日。

Raf激酶抑制蛋白抑制涉及LIN28和let-7的转移信号级联

苏拉布希·丹吉·加里梅拉 1, 杰恩云, 伊娃·M·伊夫斯, 马丁·纽曼, 斯特凡·J·埃尔克兰, 斯科特·哈蒙德, 安迪·J·明, 玛莎·里奇·罗斯纳
附属公司

Raf激酶抑制蛋白抑制涉及LIN28和let-7的转移信号级联

Surabhi Dangi加里梅拉等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

Raf激酶抑制蛋白（RKIP）负调节MAP激酶（MAPK）、G蛋白偶联受体激酶-2和NF-kappaB信号级联。RKIP被认为是前列腺癌的转移抑制因子，但其机制尚不清楚。在这里，我们显示RKIP抑制转移性乳腺癌细胞的侵袭，并抑制原位小鼠模型中乳腺癌细胞灌注和骨转移。其机制涉及抑制MAPK，导致Myc降低LIN28的转录。抑制LIN28可以增强乳腺癌细胞的let-7处理。let-7表达升高抑制HMGA2，HMGA2是一种染色质重塑蛋白，可激活包括蜗牛在内的前侵袭和前介导基因。LIN28缺失和let-7表达可抑制骨转移，LIN28可恢复携带RKIP表达乳腺癌细胞的小鼠的骨转移。这些结果表明，RKIP部分通过涉及MAPK、Myc、LIN28、let-7和下游let-7靶点的信号级联抑制侵袭和转移。RKIP对两种多能干细胞基因Myc和LIN28的调节，突显了RKIP作为一种关键的转移抑制剂和潜在治疗剂的重要性。

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数字

图1
图1
RKIP调节乳腺癌的侵袭和转移。(一个)RKIP在MCF10A乳腺中表达，在转移性MDA-MB-231细胞中耗尽。用wt或S153E RKIP稳定转导MDA-MB-231细胞，并用抗RKIP或抗微管蛋白抗体免疫印迹裂解物。(B类)Wt和S153E RKIP抑制MDA-MB-231细胞的侵袭。按照材料和方法中的描述，对细胞进行侵袭检测。结果表示四个独立样本的平均值±标准偏差(P（P）重量<0.001P（P）=0.002，对于S153E RKIP（相对于控制）。(C类，天)wt和S153E RKIP在嗜肺（4175）或嗜骨（1833）乳腺癌细胞中的表达。用wt或S153E RKIP稳定转导细胞，并用抗RKIP或抗微管蛋白抗体免疫印迹裂解物。（C）中的所有通道均来自同一凝胶，但省略了样品2后的一个通道，从而得到了一个合成图形(E类，如果)Wt和S153E RKIP抑制嗜肺细胞（4175）或嗜骨细胞（1833）的侵袭。如材料和方法中所述，对稳定表达对照载体wt RKIP或S153E RKIP的1833个细胞进行侵袭检测。结果表示四个独立样本（4175）的平均值±标准偏差，或三个样本（1833）的平均数±标准偏差(P（P）对于wt RKIP和P（P）S153E RKIP相对于对照4175细胞<0.05；P（P）=0.02，对于wt RKIP和P（P）相对于对照1833个细胞，S153E RKIP<0.001）。(G公司)Wt和S153E RKIP抑制嗜骨性肿瘤细胞的灌注（1833）。将稳定表达对照载体（6只小鼠）、wt RKIP（5只小鼠）或S153E RKIP的1833细胞注射到小鼠的乳腺脂肪垫中。3周后，对从血液中分离出来的细胞进行GAPDH转录物分析，这些转录物来自人类（肿瘤）或小鼠（对照）。结果表示动物的平均值±标准差(P（P）<0.002，对于wt RKIP和P（P）<0.001，S153E RKIP相对于对照）。(H（H），我)Wt和S153E RKIP抑制骨转移。将表达荧光素酶和对照载体的1833个细胞（6只小鼠）、wt RKIP（7只小鼠）或S153E RKIP（7只鼠）注射到小鼠的左心室，3周后对小鼠进行荧光素酶活性成像。典型图像显示，RKIP wt和S153E大大减少了颅骨的骨转移（H，右上面板；右下面板）。稳定表达荧光素酶的1833细胞在注射到小鼠体内之前具有相同的荧光素素酶报告活性（H，左下面板）。对小鼠颅骨的可比较区域进行光学成像和量化。结果（I）代表动物的平均值±标准差(P（P）对于wt RKIP和P（P）与对照组相比，S153E RKIP<0.01）。
图2
图2
RKIP调节let-7HMGA2和蜗牛。(一个)Wt和S153E RKIP增加let-7a和let-7g表达式。对表达对照、wt或S153E的1833个细胞进行检测let-7a或let-7g通过qRT–PCR。结果表示三个样本的平均值±s.d(P（P）=0.03，对于wt RKIP和P（P）与对照组相比，S153E RKIP＜0.01）。(B类)MCF10A细胞RKIP耗竭抑制let-7a和let-7g表达式。测定表达人RKIP对照载体或shRNA的MCF10A细胞let-7a或let-7g通过qRT–PCR。结果表示三个样品的平均值±标准偏差(P（P）MCF10A/shRKIP相对于MCF10A细胞<0.0001）。用抗RKIP或抗管蛋白抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。(C类)Pre-miR公司let-7a降低蜗牛mRNA水平。从转染前miR基因的1833细胞中分离的蜗牛mRNAlet-7a通过qRT-PCR进行定量。结果表示三个样品的平均值±标准偏差(P（P）<0.02let-7a相对于控件）。(天)反miRlet-7a增加蜗牛mRNA水平。从1833细胞中分离稳定表达S153E RKIP的蜗牛mRNA并转染抗miRlet-7a通过qRT-PCR进行定量。结果表示三个样品的平均值±标准偏差(P（P）=0.03（对于抗miR）let-7a相对于控件）。(E类)RKIP抑制HMGA2表达。对表达载体wt或S153E RKIP的1833个细胞进行裂解，并用抗HMGA2或抗管蛋白抗体进行免疫印迹。(如果)RKIP抑制蜗牛表达，RKIP拯救蜗牛表达let-7-不敏感HMGA2。从1833个表达控制载体wt RKIP、S153E RKIP或S153E R KIP和HMGA2的细胞中分离出蜗牛mRNA，这些细胞缺乏结合3′-非翻译区let-7（ORF）。通过qRT-PCR定量蜗牛mRNA。结果表示三个独立样本的平均值±标准偏差(P（P）<0.001（wt RKIP和S153E RKIP相对于对照）。(G公司，H（H）)Let-7公司调节入侵。用对照或前miR转染1833个细胞let-7a和表达S153E或wt RKIP的1833个细胞被转染对照或抗miRlet-7a如材料和方法中所述，对细胞的侵袭进行分析。结果表示四个独立样本的平均值±标准偏差。(P（P）=0.004（对于预miR）第7列相对于控制，P（P）=0.008，针对S153E RKIP细胞中相对于对照的抗miR let-7，以及P（P）=0.025（对于抗miR）let-7相对于重量RKIP单元中的对照组）。(我，J型)HMGA2调节入侵。用HMGA2 ORF或HMGA2 shRNA（shHMGA2）转染1833细胞。在HMGA2 ORF转染后18和48小时，或shHMGA2转染后48小时，对细胞进行裂解，并用抗HMGA2或抗微管蛋白抗体进行免疫印迹。按照材料和方法中的描述，对细胞进行侵袭检测。结果表示三个独立样本（I:P（P）HMGA2相对于对照组=0.02；记者：P（P）shHMGA2相对于对照组<0.04）。结果代表了至少三个独立实验。
图3
图3
RKIP诱导let-7通过抑制LIN28。(一个)Let-7克由强力霉素诱导。表达诱导因子的1833个细胞let-7g用2μg/ml多西环素处理指定时间。结果表示三个样品的平均值±标准偏差(P（P）=0.006（24小时）P（P）与对照组相比，48小时处理=0.004）。(B类)Let-7克抑制骨转移。表达荧光素酶和对照载体（7只小鼠）或tet诱导型的1833细胞let-7g（7只小鼠）在2μg/ml多西环素存在下生长24h。将细胞注入小鼠左心室，2天后，给小鼠饮用仅含4%蔗糖的饮用水或2mg/ml多西西环素和4%蔗糖的饮水。在3周后对小鼠的萤光素酶活性进行成像。代表性图片显示let-7g大大减少了颅骨的骨转移。结果表示动物的平均值±标准差(P（P）=0.001let-7g相对于控件）。(C类)RKIP不会改变主设备let-7表达式。对表达对照载体wt RKIP或S153E RKIP的1833个细胞进行裂解。主要let-7a和let-7g通过qRT-PCR分析转录物。结果表示三个样品的平均值±标准差。(天)LIN28禁用let-7表达式。用LIN28表达载体稳定转染表达对照、wt RKIP或S153E RKIP的1833个细胞。莱特-7a和克通过qRT-PCR分析转录物。左：结果代表三个样品的平均值±标准差(P（P）=0.01和P（P）与对照组相比，LIN28（wt RKIP细胞和S153E RKIP电池）分别<0.001；右：对表达对照载体wt RKIP或S153E RKIP的1833个细胞进行裂解，并用抗LIN28或抗管蛋白抗体进行免疫印迹。结果代表了至少三个独立实验。(E类)RKIP降低了1833个细胞的LIN28 mRNA。对表达对照载体wt RKIP或S153E RKIP的1833个细胞进行裂解。用qRT-PCR分析LIN28转录本。左：结果代表三个样品的平均值±标准差(P（P）=0.003，对于wt RKIP和P（P）=0.002（对于S153E RKIP相对于控制）；右：对表达对照载体wt RKIP或S153E RKIP的1833个细胞进行裂解，并用抗LIN28或抗管蛋白抗体进行免疫印迹。结果代表了至少三个独立实验。(如果)shLIN28下调LIN28的表达。裂解表达对照载体或shLIN28的1833个细胞，并用抗LIN28或抗微管蛋白抗体进行免疫印迹。结果代表了至少三个独立实验。(G公司)LIN28耗竭抑制1833细胞的侵袭。如材料和方法所述，对表达对照载体或shLIN28的1833个细胞进行侵袭检测。结果表示三个独立样本的平均值±标准差(P（P）相对于对照，shLIN28为0.003）。(H（H）)ShLIN28抑制骨转移。将表达荧光素酶和载体控制（7只小鼠）或LIN28 shRNA（8只小鼠）的1833个细胞注射到小鼠左心室。3周后对小鼠进行荧光素酶活性成像。结果表示动物的平均值±标准差(P（P）=0.002，对于shLIN28相对于Control）。
图4
图4
Myc调节LIN28转录。(一个)RKIP下调Myc表达。印迹：对表达对照载体wt RKIP或S153E RKIP的1833个细胞进行裂解，并用抗Myc或抗管蛋白抗体进行免疫印迹。结果代表了至少三个独立实验。图：结果表示三个独立样本的平均值±标准差(P（P）=0.03，对于wt RKIP和P（P）=0.003，对于S153E RKIP（相对于控制）。(B类)Myc调节LIN28的表达。用干扰对照或siRNA转染Myc的1833细胞（左）或用对照或Myc表达载体转染的1833 S153E RKIP细胞（右）进行裂解，并用抗Myc、抗LIN28或抗管蛋白抗体进行免疫印迹。结果代表了至少三个独立实验。(C类)左图：Myc调节LIN28转录水平。用Myc的对照或siRNA转染1833个细胞。转染48小时后，通过qRT-PCR分析LIN28和Myc转录物。右：用对照或Myc表达载体转染表达S153E RKIP的1833个细胞。转染后48小时，用qRT-PCR分析LIN28转录物。结果表示三个样品的平均值±标准偏差(P（P）对于siMyc和P（P）Myc相对于对照组<0.0001）。(天)Myc调节let-7表达式。用Myc的对照或siRNA转染1833个细胞。莱特-7a和克转染48小时后用qRT-PCR分析转录物。用对照或Myc表达载体转染表达S153E RKIP的1833个细胞。莱特-7a和克转染后48小时通过qRT-PCR分析转录物。结果表示三个样品的平均值±标准偏差(P（P）对于siMyc和P（P）相对于对照组，Myc＜0.01）。(E类)Myc通过与启动子结合调节LIN28转录。LIN28启动子与假定Myc-binding位点的示意图。用抗Myc抗体和抗Jun抗体（ChIP试验的阳性对照）进行染色质免疫沉淀（ChIPs）。使用LIN28、WNT5A（阳性对照）、CyclinD1（ChIP试验阳性对照）和β-珠蛋白（阴性对照；NC）启动子中的引物，通过qRT-PCR分析ChIP。结果表示三个样品的平均值±标准偏差(P（P）LIN28相对于IgG<0.004）。(如果)RKIP调节Myc与LIN28启动子的结合。利用LIN28启动子上的抗Myc抗体进行染色质免疫沉淀（ChIP）。表达对照载体（C）、wt RKIP或S153E RKIP的1833个细胞在48 h血清饥饿后用2%血清或2%血清U0126（10μM）处理2 h。结果表示三个样品的平均值±标准偏差(P（P）相对于未经处理的对照组，wt RKIP S153E RKIP分别为0.01和0.001）。(G公司)Myc表达调节1833个细胞的侵袭。上图：按照材料和方法中的描述，对1833个转染有Myc干扰对照或siRNA的细胞进行侵袭检测。结果表示三个独立样本的平均值±标准差(P（P）=0.004，siMyc相对于对照组）。底部：按照材料和方法中的描述，对转染有Myc载体控制或表达载体的1833个S153E RKIP细胞进行侵袭检测。结果表示三个独立样本的平均值±标准差(P（P）=0.01（Myc相对于对照组）。
图5
图5
RKIP调节let-7部分通过MAPK途径，LIN28逆转RKIP对骨转移的抑制。(一个)MEK1调节1833个细胞中的LIN28和Myc。活性MEK诱导LIN28和Myc。用控制载体（C）或MEK1-EE转染表达S153E RKIP的1833个细胞48小时。还通过qRT-PCR检测LIN28。western blot检测MEK1、Myc、lIN28和α-微管蛋白的表达。相反，慢病毒shRNA对MEK的稳定消耗下调了1833细胞中的LIN28和Myc。结果表示三个样本的平均值±s.d(P（P）=0.005，对于shMEK和P（P）相对于对照，MEK1-EE为0.001）。免疫印迹结果是至少三个独立实验的代表。(B类)U0126抑制MEK诱导let-7a并抑制HMGA2和Snail。印迹：用或不用MEK抑制剂U0126（10μM，12 h）处理1833个细胞，用HMGA2或微管蛋白抗体进行溶解和免疫印迹。图：1833个细胞用10μM U0126处理指定时间let-7a通过qRT-PCR进行分析。通过qRT-PCR定量蜗牛表达。结果表示三个样品的平均值±标准偏差(Let-7公司:P（P）相对于对照组，12、18和24小时分别为0.001、0.01和0.03；蜗牛：P（P）与对照组相比，12、18和24小时分别为0.01、0.004和0.01）。结果代表了至少三个独立实验。(C类)组分活性MEK抑制let-7a表达并诱导HMGA2和蜗牛。用对照载体或MEK1-EE转染表达S153E RKIP的1833个细胞48小时let-7a用qRT-PCR对蜗牛进行检测。结果表示三个独立样本的平均值±标准差(莱特-7a:P（P）MEK1-EE相对于对照组<0.02；蜗牛：P（P）MEK1-EE相对于对照组=0.01）。western blot检测MEK1和HMGA2的表达。结果代表了至少三个独立实验。(天)MEK调节侵袭。左图：根据材料和方法中的描述，对表达MEK1载体控制或shRNA的1833个细胞进行侵袭检测。结果表示三个独立样本的平均值±标准差(P（P）=0.004，对于shMEK1（相对于对照）。右图：表达MEK1-EE载体控制或表达载体的1833个细胞按照材料和方法中的描述进行了侵袭检测。结果表示三个独立样本的平均值±标准差(P（P）MEK1-EE相对于对照组<0.005）。(E类)可诱导Raf激酶可挽救S153E RKIP引起的侵袭抑制。表达S153E RKIP并转染对照载体或ΔRaf-1:ER的1833个细胞未经处理或用三苯氧胺（4-HT）处理。结果表示三个独立样本的平均值±标准偏差(P（P）S153E RKIP+ΔRaf-1:ER+HT相对于S153E RCKIP控制<0.001；P（P）对于S153E RKIP+ΔRaf-1:ER+HT（相对于S153E RKIP+ΔRaf-1:ER），<0.001。(如果)通过MAPK/LIN28展示RKIP调控侵袭和转移机制的方案/第7列通路。(G公司)LIN28克服了wt-RKIP对骨转移的抑制作用。表达荧光素酶的1833个细胞和对照载体或wt RKIP被稳定转染对照载体或LIN28，并注射到小鼠的左心室（对照组，6只小鼠；LIN28，5只小鼠；wt RJIP，6只鼠；wt R KIP+LIN28，五只小鼠），3周后对小鼠进行荧光素酶活性成像。结果代表动物的平均值±标准差(P（P）=0.001（相对于控制的wt RKIP），以及P（P）=0.01，对于wt RKIP+LIN28（相对于wt RJIP）。
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