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.2009年1月27日；106(4):1267-72.
doi:10.1073/pnas.0807322106。 Epub 2009年1月15日。

高频神经元活动对ProBDNF细胞外裂解的控制

古罕·纳加潘 1, 尤金·扎伊采夫, 小弗拉基米尔·塞纳托罗夫, 杨建民, 芭芭拉·伦普斯特德, 白露
附属公司

高频神经元活动对ProBDNF细胞外裂解的控制

古罕·纳加潘等。 美国国家科学院程序. .

摘要

前神经营养素和成熟神经营养素常常引起相反的生物效应。例如，成熟的脑源性神经营养因子（mBDNF）对高频刺激诱导的长期增强至关重要，而前BDNF促进低频刺激诱导的长时抑郁。由于mBDNF是通过内蛋白水解从proBDNF衍生而来的，因此调节proBDNF-裂解的机制可能控制BDNF调节的方向。使用选择性检测前BDNF或mBDNF的方法，我们发现低频刺激在培养的海马神经元中诱导了主要的前BDNF-分泌。相反，高频刺激优先增加细胞外mBDNF。抑制细胞外而非细胞内前BDNF的裂解，可大大降低高频刺激诱导的细胞外mBDNF。此外，高频而非低频刺激选择性地诱导组织纤溶酶原激活剂的分泌，这是一种参与细胞外前BDNF向mBDNF转化的关键蛋白酶。因此，高频神经元活动通过调节细胞外蛋白酶的分泌来控制细胞外原BDNF/mBDNF的比率。我们的研究表明，分泌蛋白的细胞外蛋白水解裂解受活性依赖性控制，并揭示了控制BDNF亚型截然相反功能的重要机制。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
原BDNF和mBDNF的组成性分泌与调节性分泌。(A类)培养海马神经元分泌的前BDNF和mBDNF的Western blot检测。表位标记BDNF构建物转染海马神经元(顶部)用TAC处理15分钟或12小时，或用KCl（50 mM）处理15分钟。用单克隆抗GFP抗体免疫沉淀培养基，然后用多克隆抗GFP抗体免疫印迹。(B类)在构成条件下15分钟或12小时内分泌的proBDNF和mBDNF的稳定水平。proBDNF-和mBDNF-特异性信号在12小时TAC中归一化为总BDNF（二者之和），并以总BDNF%表示。(C类)对TAC或KCl处理15分钟后神经元分泌的proBDNF和mBDNF进行量化。proBDNF-和mBDNF特异性信号表示为占总BDNF的%。n个=4个独立实验。数据表示为平均值±SEM.P，proBDNF；M、 mBDNF；ND，无法检测。
图2。
图2。
通过细胞表面染色检测proBDNF和mBDNF的组成性和调节性分泌。BDNF转染的神经元（14天以上）用TAC处理12小时或KCl（50 mM）处理15分钟，在非渗透条件下固定，并使用抗人BDNF原的单克隆HA抗体进行表面免疫标记(红色)或mBDNF特异性抗体(绿色). (A类)细胞表面染色的典型显微照片。叠加图像显示在右侧。箭头表示仅mBDN信号，箭头表示仅proBDN信号。在这张和所有显微照片中，比例尺为10μm。(B类)通过免疫染色定量树突中表面结合的proBDNF和mBDNF。TAC中神经元整个树突状区域中总BDNF（proBDNF+mBDNF）的荧光强度设置为100%，各种条件下的proBDNF和mBDNF-的值均归一化为总BDNF。共有7个神经元的26个树突(n个=7）和来自8个神经元的33个树突(n个=8）在高KCl条件下n个=3个独立实验。在本图和所有其他图中，使用InStat3.**对数据进行了分析，P（P）<0.001，配对双尾学生t吨测试。
图3。
图3。
不同频率电刺激诱导的前BDNF和mBDNF分泌的Western blot分析。大鼠海马神经元(A类)或tPA–/–神经元(B类)转染BDNF结构如图1所示A类用相同数量的HFS或LFS的电脉冲（14400）刺激。从培养基中检测到proBDNF和mBDNF的分泌（1 ml/孔×3孔，在12孔板中，板密度为0.12×106细胞/孔），使用抗GFP标签的抗体，并通过将所有数据归一化为HFS条件下的平均总BDNF信号进行量化(n个=3个独立实验）。ND，未检测到。数据以平均值±SEM表示，并通过双向方差分析进行分析，然后进行Bonferroni事后分析。*，P（P）< 0.01; **,P（P）< 0.001.
图4。
图4。
细胞表面染色显示，HFS和LFS诱导野生型和tPA–/–神经元分泌前BDNF和mBDNF。表面染色野生型图像(A类)和tPA神经元(B类)刺激15分钟后。(C类)树突表面结合的proBDNF和mBDNF的定量。野生型，TAC:来自10个神经元的30个树突；野生型，HFS：来自12个神经元的55个树突；野生型，LFS，来自9个神经元的37个树突；tPA–/–，HFS，来自5个神经元的31个树突。n.s.，不重要；**，P（P）<0.001，单因素方差分析。(D类)远端树突中mBDNF荧光点数量的分布。对应于远端树突上mBDNF的荧光点数量，以10μm的间隔装箱，根据与细胞体的距离绘制（近端距离胞体10至40μm，远端距离胞体>40μm）。相同的神经元(C类)用于此分析。插图：mBDNF点在WT-LFS和tPA（–/–）-HFS中的分布在近端和远端归一化为WT-HFS。*，P（P）<0.05，Mann-Whitney试验。结果来自3种独立的制剂。
图5。
图5。
(A类)Western blot检测内源性proBDNF的细胞内与细胞外裂解。如图所示，在没有或存在FIN-II（13μM）或PAI-I（1μg/ml）的情况下，用KCl、HFS或LFS刺激神经元。用鸡多克隆“pro/m”抗体免疫沉淀法测定内源性BDNF分泌，该抗体识别具有相同亲和力的proBDNF和mBDNF，并用鸡IgY沉淀琼脂糖进行免疫沉淀，然后用兔多克隆“pro/m”抗原进行Western blot。对条带进行量化，并表示为总BDNF的%(n个=4个独立实验）。*，P（P）<0.001，双向方差分析，然后进行Bonferroni事后分析；RP，重组proBDNF；rM，重组mBDNF。(B类)tPA的频率依赖性分泌。如图4所示，刺激转染tPA-Venus的培养海马神经元分泌tPA。显示通过多克隆抗-GFP抗体和抗tPA抗体检测到的tPA-Venus的代表性蛋白质印迹。HFS和LFS中tPA-Venus释放的相对值归一化为TAC条件下tPA信号，并以倍数增加的形式表示。多次实验中相同条件下的数据(n个=3）取平均值，表示为平均值±SEM。*，P（P）<0.001，双向方差分析后进行Bonferroni事后分析。
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