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.2008年12月15日；22(24):3409-21.
doi:10.1101/gad.1735208。

A型和B型核层粘连网络：涉及染色质组织和转录的微域

武士世美 1, 凯特琳·弗莱加, 小岛信一郎, Chan-Gi包, 伊琳娜·索洛维, 安妮·E·戈德曼, 斯蒂芬·A·亚当, 戴尔·K·舒马克, Masataka Kinjo公司, 托马斯·克莱默, 罗伯特·D·戈德曼
附属公司

A型和B型核层粘连网络：涉及染色质组织和转录的微域

武士世美等。 基因开发. .

摘要

核层粘连蛋白在调节染色质的复制、转录和表观遗传修饰中发挥作用。然而，这些层粘连功能的机制尚不清楚。我们证明，A型和B型层粘连蛋白在叶片中形成独立但相互作用的稳定网络，并且根据荧光相关光谱（FCS）的测定，在核质中具有不同的迁移率。沉默层粘连蛋白B1（LB1）的表达会显著增加层粘连膜网络的大小和核质层粘连A（LA）的流动性。叶片网孔尺寸的变化与LB2缺乏的富含LA/C的核包膜泡的形成有关。显微切割水泡的比较基因组杂交（CGH）分析、荧光原位杂交（FISH）和修饰组蛋白的免疫荧光定位表明，基因丰富的常染色质与LA/C水泡相关。过度磷酸化RNA聚合酶II（Pol II）和组蛋白标记的活性转录富集表明blebs具有转录活性。然而，RNA的体内标记表明转录减少，表明富含LA/C的微环境诱导Pol II的启动子近端停滞。我们认为不同的层粘连被组织成独立但相互作用的微域，LB1对其组织至关重要。我们的证据表明，染色质的组织和调节受这些层粘连微结构域之间的相互连接的影响。

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数字

图1。
图1。
用双标记共聚焦免疫荧光法测定LA/C和LB1的分布。赤道剖面上可以看到单个核的LA/C（绿色）和LB1（红色）(A–I类)和核表面(J–O公司). 中白色方块表示的区域C类和L（左）放大了五倍D–I型和M–O型分别是。(P（P）)显示沿虚线的荧光强度剖面的线扫描O（运行）这些图像表明，层粘连主要形成具有一些重叠区域的独立网络。棒材，5μm。
图2。
图2。
通过共聚焦免疫荧光测定沉默HeLa细胞中LA/C、LB1或LB2的效果。(A类)等效蛋白载量的免疫印迹显示对照细胞和沉默细胞的全细胞裂解液中的层粘连蛋白表达水平。LA/C和LB1或LB2定位于沉默细胞和对照。(B–Q类)静音矢量显示在左边侧面。LA/C显示为绿色，而LB1和LB2显示为红色。对照组是转染了打乱序列shRNA的细胞(B类,C类)赤道地区。(D类,E类)同一核的表面。棒材，5μm。(R（右）)对照细胞和沉默细胞中的膜内网格尺寸变化。在对照组、LA/C和LB2沉默细胞中，筛孔尺寸在分辨率极限（0.04μm）范围内2，假设最小网格的形状为正方形）至1.3μm2（中值：0.13–0.15μm2所有层粘连蛋白）。使用方框图显示数据。条形图显示测量的最大和最小网格尺寸。分隔矩形区域的线是所有测量值的中间值。这个顶部矩形区域显示了50%–75%的网格尺寸测量值的分布；然而底部矩形的一部分显示了网格尺寸测量值的25%-50%的分布。使用PlanApochro 100×，1.40 NA油浸透镜拍摄图像。在LB1沉默细胞中，筛孔尺寸为0.04μm2至15微米2对于LA/C和45μm2用于LB2(n个10个核=2000–3000，中位数：0.6–0.7μm2).
图3。
图3。
LA/C和LB2在LB1沉默细胞中共定位。LA/C和LB2分别以绿色和红色显示。在不同的焦平面上可以看到一个在椎板上有扩大网状结构的单个核和几个小气泡A–R.拍摄了荧光图像的Z堆叠，核表面和赤道平面如所示A–I类和J–R公司分别是。叶片网格的指示区域C类放大并显示在D–I型中平面部分所示薄板内的其他区域L（左）放大倍数较高时M–O型描绘了富含LA/C的斑块和富含LA/C-的小气泡（如所示P–R（P–R）). LB1沉默细胞的另一个细胞核包含两个泡S公司和T型这些泡中较大的泡具有显著增大的LA/C网状结构；参见中矩形区域的高放大视图S公司，放大了约2.4倍T型.棒材，5μm。
图4。
图4。
用FCS测量活HeLa细胞中GFP-LA、LB1、LB2和LC的迁移率。FCS测量前后GFP-LA的荧光图像如所示A类和B类分别是。中的十字线插入在里面A类表示FCS测量的点。中的箭头插入在里面B类表示在FCS测量期间漂白的叶片内的区域。棒材，5μm。(C类)核质中GFP-LA、LB1、LB2和LC的代表性荧光涨落随时间变化（黄色线表示GFP-LA，蓝色线表示GFP-LC，绿色线表示GFP LB1，红色线表示GFPLB2）。(D类,E类)请注意，LB1和LB2会迅速进行光漂白。通过FCS测量GFP-LA和LC在LB1和LB2沉默细胞中的活动性。根据荧光波动计算对照、LB1和LB2沉默细胞核质中GFP-LA和GFP-LC的平均正常荧光自相关曲线，并绘制为相关时间τ的函数（微秒）（蓝色点代表对照细胞，绿色点代表LB1沉默细胞，红色点代表LB2沉默细胞）。G（τ）是荧光自相关函数。
图5。
图5。
(A–H)共聚焦免疫荧光法评估LB1沉默细胞中与LA/C膜扩大网状结构相关的染色质修饰状态。使用抗LA/C（绿色）和抗AcH3（红色）对沉默细胞进行双标记免疫荧光处理，并使用Hoechst 33258（白色/蓝色）进行复染。层内的网格区域D类放大并显示在E–H（E–H）. (J–Y)LB1沉默核团的一系列赤道共焦免疫荧光图像。在J–M公司，水泡在顶部 正确的细胞核中含有LA/C，但没有LB2。在N–Q号，滤泡中存在AcH3，用Hoechst 33258弱染色，无LB1。R–U型图中显示一个细胞核有一个气泡，没有H3K9me2（H3K9）和LB1，并且用Hoechst 33258染色很弱。V–Y通过双重复制标签显示早期（绿色）和中后期复制模式（红色）。DNA用Hoechst 33258（蓝色）复染。(Z–交流)在具有核泡的LB1沉默细胞中的着丝粒的Z投影图像通过用CREST抗血清（红色）进行免疫染色而可视化。DNA用Hoechst 33258（蓝色）复染。棒材，5μm。箭头指示气泡的位置。(我)对照和LB1沉默细胞细胞核中AcH3和H3K9me2的荧光强度。在每种情况下，分别在两个实验中测定40-150个核的荧光强度。正常网格（<1.3μm）的对照细胞和LB1沉默细胞的相对荧光强度2)和大网孔（>1.3μm2)在直方图中分别绘制为绿色、黄色和红色条。误差条表示±SD。带星号的条显示重大变化(P（P）与对照组相比，LB1沉默细胞中AcH3和H3K9me2的相对荧光强度为<0.05）。
图7。
图7。
(A类)来自LB1沉默细胞的20个滤泡的CGH图谱。绿色和红色通道的荧光强度被描述为每个染色体旁边的强度比轮廓。核泡中过度代表的区域用绿色条表示，而代表不足的区域用红色条表示。请注意，18号染色体区域的代表性不足，6p、17号染色体区域和19号染色体区域代表性过高。(B类,C类)LB1沉默细胞的染色体分布。DNA用Hoechst 33258进行复染。DNA、染色体6p（或19）和染色体6q（或18）分别以蓝色、绿色和红色显示。棒材，5μm。(D类)带有核泡的LB1沉默细胞中6q/6p和18/19绘画探针的分布百分比。误差线为±SD。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

  • 解开薄板网络。
    Zwerger M，Medalia O。 Zwerger M等人。 Nat Rev Mol细胞生物学。2012年2月15日；13(3):140. doi:10.1038/nrm3291。 Nat Rev Mol细胞生物学。2012 PMID：22334141 没有可用的摘要。

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