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.2009年3月；20（5）：1360-73。
doi:10.1091/mbc.e08-05-0475。 Epub 2009年1月7日。

人IST1的生化分析及其在胞质分裂中的作用

莫妮卡·巴约雷克 1, 盛田英治, 杰克·J·斯卡利基, 斯科特·莫勒姆, 马库斯·巴斯特, 韦斯利·桑奎斯特
附属公司

人IST1的生化分析及其在胞质分裂中的作用

莫妮卡·巴约雷克等。 分子生物学细胞. 2009年3月.

摘要

新描述的运输（ESCRT）蛋白增加钠耐受性-1（Ist1p）所需的酵母内体分选复合物结合晚期作用的ESCRT蛋白Did2p/带电MVB蛋白（CHMP）1和Vps4p，当与Vta1p/LIP5-Vps60p/CHMP5复合物突变结合时，表现出合成空泡蛋白分选缺陷。在这里，我们报道了人类IST1也在ESCRT途径中发挥作用，并且是HeLa细胞胞质分裂期间有效脱落所必需的。对IST1与VPS4、CHMP1、LIP5和ESCRT-I的结合作用进行了表征，并对IST1-VPS4的相互作用进行了详细研究。突变和核磁共振波谱研究表明，IST1末端包含两个不同的MIT相互作用基序（MIM1和MIM2），它们包裹并结合在MIT螺旋束的不同凹槽中。IST1、CHMP1和VPS4被招募到分裂细胞的中体，耗尽IST1或CHMP1蛋白都会阻止VPS4的招募和脱落。相反，IST1缺失并没有抑制人类免疫缺陷病毒-1的出芽。因此，IST1和CHMP1共同招募和调节细胞分裂最后阶段所需的特定VPS4活性。

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数字

图1。
图1。
IST1绑定交互。（A） IST1与其他人类ESCRT途径蛋白的酵母双杂交相互作用。IST1-AD融合子（第2列，IST1）或对照AD结构子（第1列，Empty）与对照DBD结构子（第一列，Empt）或ESCRT蛋白–DBD融合子共同表达（第2-26列），并测试阳性酵母双杂交相互作用（左）或共转化（右）。在本试验中，IST1与CHMP1A、CHMP1B、VPS4A、VPS4B和LIP5呈阳性相互作用。（B） IST1结合ESCRT-I。左，ESCRT-I与空载体对照（泳道1）或一个STrEP FLAG（OSF）-IST1（泳道2）共沉淀。在这些实验中，所有四个ESCRT-I亚基都与N-末端Myc表位标签共表达。对，纯重组ESCRT-I复合物与GST-IST1的结合大肠杆菌提取物。右上角，考马斯染色SDS-PAGE凝胶，显示纯重组ESCRT-I（通道1）、GST或GST-IST1对照提取物（通道2和3）和ESCRT-1下拉反应（通道4和5）。右下角，Western blot显示了FLAG-TSG101/ESCRT-I亚基在与顶面板第2-5条通道对应的反应中的基质结合水平。（C） IST1结合CHMP1A。左侧，Myc-CHMP1A共沉淀与空病媒控制（1、3和5号车道）、OSF-IST1（2号车道）和OSF-IST11-189（车道4），或OSF-IST1190-366（第6车道）。右侧，Myc-CHMP1A（车道1和2）和Myc-CHMP 1AL191A/L184A（车道3和4）与空病媒控制（车道1和3）和OSF-IST1（车道2和4）的共沉淀。（D） IST1结合LIP5。左侧，Myc-LIP5共沉淀与空病媒控制（1、3和5道），或OSF-IST1（2道），OSF-IST11-189（车道4）或OSF-IST190-366年（第6车道）。右侧，内源性IST1共沉淀与空病媒控制（1、3和5通道）、OSF-LIP5（2通道）、1-186（车道4），或OSF-LIP5197-307（第6车道）。（E） IST1蛋白相互作用概述。域缩写：VSL，五ta1型/S公司业务流程1/L（左）IP5域；UEV、，U型蚊香素E类2五变异域；PRD，脯氨酸-第页脑出血d日奥曼；NTD/CTD、N端和C端结构域；β、 β-结构域；AAA ATP酶，A类T酶一与多种细胞相关一活动。
图2。
图2。
IST1与VPS4A MIT互动。（A） IST1和指定VPS4A结构之间的酵母双杂交相互作用。图中显示了两种混合相互作用（顶部）或共转换控制（底部）。注意，IST1显示出与VPS4A MIT结构域的正双杂交相互作用，但与VPS4A-ATP酶盒没有相互作用（比较通道2、3和4）。（B） IST1有两个不同的MIM元素。顶部，对齐IST1321-366（顶部）使用CHMP6 MIM2和CHMP1A MIM1（中间），以及MIM一致序列（底部）。底部，生物传感器结合等温线显示纯VPS4A MIT与GST-IST1蛋白质的结合大肠杆菌提取物。VPS4A MIT结合的估计离解常数（微摩尔）如下：IST1，1.1（黑色）；IST1型303-366年，0.8（红色）；IST1型323-339，12.4（蓝色）；IST1型340-366，26（绿色）；和IST11-189，>1500（橙色）。VPS4A MIT与GST表面的背景结合可以忽略不计（数据未显示）。（C） IST1 MIM1和MIM2的突变分析。显示纯化VPS4A MIT与GST-IST1蛋白结合的生物传感器结合等温线大肠杆菌提取物。VPS4A MIT结合的估计离解常数（微摩尔）如下：IST1，1.1（黑色）；IST1型L325D型, 8; IST1型L328D型, 16; IST1型l355甲，17；IST1型L362A型9（单个突变体为蓝色和紫色）；IST1型L325D/L355A型, 88; IST1型L328D/L355A型, 502; 和IST1L328/L362型432（双突变体为红色和橙色）。（D） VPS4A MIT上IST1 MIM1和MIM2结合位点的NMR化学位移映射。图中显示了映射到VPS4A MIT域的空间填充模型上的IST1 MIM1的结合所移动的残基。所示为具有结构特征的CHMP1A MIM1（顶部；绿色）和CHMP6（中部；蓝色）元件的结合模式，以供参考。底部面板显示了VPS4A MIT-IST1的基于结构的卡通模型321至366复合体，三个VPS4A MIT螺旋以灰色表示，IST1 MIM1和MIM2元素分别以绿色和蓝色表示。（E） LIP5绑定IST1的MIM1/MIM2区域。野生型（WT）Myc-IST1（车道1和2）或Myc-IST1L328D/L355A型（车道3和4）与空病媒控制（车道1和3）或OSF-LIP5（车道2和4）的共沉淀。
图3。
图3。
IST1过度表达可抑制HIV萌芽，但IST1缺失不会。（A） IST1过度表达降低HIV-1的释放和滴度。HIV-1载体与空载体（1号道，阴性对照）或表达GFP-VPS4A（2号道，阳性对照）、GFP-VPS4A的载体共表达时的蛋白质水平（Western blot）和载体滴度（感染单位每毫升；底部）K173Q系列（车道3，阳性对照）、IST1（车道4）或IST1L328D/L355A型（第5车道）。Western blots显示细胞内IST1（顶部，抗IST1）、细胞内HIV Gag蛋白（中部，抗CA）和病毒相关CA蛋白（底部，抗CA。（B） IST1缺失不会降低HIV-1载体的释放或滴度。HIV-1载体与两个不相关的siRNA（第1和第2道，阴性对照）、一个针对TSG101的siRNA（阳性对照，第3道）或两个不同的siRNAs针对IST1（第4和第5道）共表达时的蛋白质水平（Western blots）和载体滴度（底部）。Western blots显示细胞内TSG101（第1组，抗TSG101）、细胞内IST1（第2组，抗IST1）、细胞间HIV Gag蛋白（第3组，抗CA）和病毒相关CA蛋白（第4组，抗-CA）。
图4。
图4。
有效的胞质分裂需要IST1。（A） IST1缺失导致细胞在胞质分裂期间停滞并积聚多个细胞核。用对照siRNA（TOP）或针对IST1的siRNA处理的HeLa细胞的共焦免疫荧光图像（BOTTOM）。微管（抗α-管蛋白，红色）和细胞核（SYTOX-绿色）染色作为参考；白色箭头突出显示多核细胞，黄色箭头突出显示胞质分裂中停滞的细胞。对，用不相关的对照siRNA或两种不同的siRNA中的任何一种对IST1进行处理后，对多核细胞（暗条）或中体细胞（亮条）进行量化。（B） IST1缺失阻断了胞质分裂的脱落期。IST1耗尽的分裂细胞的时间推移、相位对比图像。图中显示了一个IST1缺失的细胞，该细胞在胞质分裂后期停止（t=147分钟；在面板上方提供了经过的时间），长时间（t=147-609分钟）通过中体被束缚，然后最终恢复形成多核细胞（t=616分钟）。补充图S3中提供了完整的电影。（C） 用siRNA-resistant IST1构建物挽救胞质分裂缺陷。内源性IST1（通道2）耗尽后，或IST1耗尽后，外源性野生型IST1或具有两组不同MIM1/MIM2突变（通道4和5）的IST1结构体重新表达后，具有多核（暗条）或中体（亮条）的细胞百分比。第1栏显示了用对照siRNA处理并用空表达载体共同转染的细胞。Western blots（下图）显示细胞IST1水平和抗α-微管蛋白负荷控制。
图5。
图5。
CHMP1蛋白是高效胞质分裂所必需的。同时耗尽CHMP1A和CHMP1B会导致细胞在胞质分裂期间停滞并积聚多个细胞核。顶部的共聚焦免疫荧光图像与图4A中所示的图像类似，但底部面板中的细胞被靶向CHMP1A和CHMP1B的siRNA处理。底部，多核细胞（暗条）或中体细胞（亮条）的量化。这些实验与图4C中所示的实验类似，不同之处在于：1）用针对CHMP1A和CHMP1B的不同对siRNAs处理细胞，2）由于CHMP1B抗体尚不可用，因此只检测了CHMP1A蛋白水平。
图6。
图6。
IST1定位在细胞周期中发生变化。显示细胞周期不同阶段内源性HeLa IST1（抗IST1，绿色，第2列）定位的代表性图像。放大的插图显示IST1在前期和中期早期（第2行和第3行）集中在微管组织中心/中心体，在胞质分裂后期集中在中体（第7行）。相应的图像显示微管的定位（抗α-管蛋白，白色，第1列）、合并图像（第3列）和微分干涉对比（DIC）图像（第4列）。
图7。
图7。
IST1和VPS4的中体定位要求。（A） IST1定位到分裂细胞弗莱明体的要求。双标记共聚焦免疫荧光图像显示内源性IST1在HeLa细胞分裂中的定位（抗IST1，绿色，第2列）；微管（抗α-微管蛋白，红色，第1列）；以及合并的放大视图（第3列）。在存在对照siRNA（第1行）和IST1（第2行）、CHMP1A和CHMP1B（第3行）或VPS4A和VPS4B（第4行）缺失的细胞中显示IST1定位模式。下文量化了不同条件下具有可观察IST1的中体百分比。请注意，IST1集中在中体（箭头）内的双环结构中，除非IST1本身耗尽。（B） VPS4B定位到分裂细胞弗莱明体的要求。双标共焦免疫荧光图像显示内源性VPS4B在HeLa细胞分裂（抗VPS4B，绿色，第2列）、微管（抗α-微管蛋白，红色，第1列）和合并放大视图（第3列）中的定位。下文量化了不同条件下具有可观察VPS4B的中体百分比。请注意，当IST1、CHMP1或VPS4蛋白耗尽时，VPS4B不能有效地补充到中体（箭头）。（C） Western blot显示了在A和B所示的不同实验条件下IST1、VPS4、CHMP1和α-Tubulin蛋白的相对水平。注意，CHMP1A/B耗竭降低了VPS4A水平，VPS4A/B耗损将CHMP1A降低到无法检测的水平。（D） 抑制VPS4-MIT结合的IST1突变不会抑制中体定位。野生型IST1-Myc蛋白（第1行，第2列）和缺乏结合VPS4-MIT结构域能力的IST1突变体（IST1L328D、L355A-Myc，第2行，第2列）定位于分裂细胞的中体。微管定位（抗α-微管蛋白，红色，第1列）和合并放大视图（第3列）也可供参考。
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