Dicer is regulated by cellular stresses and interferons

doi:10.1016/j.molimm.2008.11.012

.2009年3月；46(6):1222-8.

doi:10.1016/j.molimm.2008.11.012。 Epub 2008年12月31日。

Dicer受细胞应激和干扰素调节

詹妮弗·维森¹, 托马斯·托马西

附属公司

PMID： 19118902
预防性维修识别码：项目经理2678889
内政部： 2016年10月10日/j.molimm.2008.11.012

Dicer受细胞应激和干扰素调节

詹妮弗·维森等。分子免疫. 2009年3月.

.2009年3月；46(6):1222-8.

doi:10.1016/j.molimm.2008.11.012。 Epub 2008年12月31日。

作者

詹妮弗·维森¹, 托马斯·托马西

附属

¹美国纽约州布法罗Elm&Carlton Streets，Elm&Callton Street，免疫学系，罗斯韦尔公园癌症研究所，分子医学实验室，14263。

PMID： 19118902
预防性维修识别码：项目经理2678889
内政部： 2016年10月10日/j.molimm.2008.11.012

摘要

microRNA的生成依赖于RNase III酶Dicer，其水平在不同的正常细胞和疾病状态中不同。我们证明，JAR滋养层细胞和其他几种细胞类型中Dicer蛋白的表达受到多种应激的抑制，包括活性氧、佛波酯和Ras癌基因。此外，双链RNA和I型干扰素抑制Dicer蛋白，而IFN-γ诱导Dicer。应激和干扰素的影响主要是转录后的。研究结果表明Dicer是一种应激反应成分，并将干扰素确定为Dicer表达的潜在重要调节因子。

PubMed免责声明

数字

**图1。Dicer蛋白和活性在不同的细胞类型之间受到不同的调节**
**答：。**通过western blotting分析未处理的JAR、JEG-3、HeLa、Raji和Daudi细胞的Dicer和βactin水平。B。通过实时定量RT-PCR评估上述每个细胞系的Dicer和GAPDH mRNA水平，并用C表示_T型值。**C、。**评估JAR、HeLa和Raji细胞的Dicer活性。用合成的前miR-122a和缓冲液在37°C下测定每个细胞系或重组Dicer酶的细胞质提取物2小时。通过定量RT-PCR测定成熟miR-122a水平相对于重组骰子的活性，并表示为ΔC_T型值。通过miRNA微阵列分析确定组成性表达的miR，并以每个细胞系中组成性表达miR的百分比表示。

**图2。HDACi（TSA）下调人JAR和JEG-3滋养层细胞以及小鼠B16黑色素瘤细胞系中Dicer蛋白但不下调信息水平**
体外用TSA处理JAR（50nM）、JEG-3（250nM）和B16（100nM）细胞系24小时；回收总RNA并制备全细胞裂解物。Dicer蛋白表达的蛋白质印迹和实时RT-PCR分析（报告为C_T型Dicer mRNA水平的值）。

**图3。HDACi对Dicer活性和表达的影响**
**答：。**用50nM TSA、合成前miR-122a和37°C缓冲液分析JAR细胞系或重组Dicer酶的细胞质提取物2小时。通过定量RT-PCR测定成熟miR-122a水平相对于未处理样品的活性，并以ΔC表示_T型值。B。用丙戊酸（250μM，24小时）和TSA（50nM，24 h）处理JAR细胞。收集蛋白质并通过western blotting分析Dicer和βactin水平。

**图4。多种应激途径下调Dicer蛋白**
A类用500μM H处理JAR滋养层细胞₂哦₂清洗4小时，然后再培养20小时。收集蛋白质并通过western blotting分析Dicer和βactin水平。B。用空逆转录病毒载体或激活的Ras构建物转导IMR-90人成纤维细胞（18）。收集蛋白质并通过western blotting分析Dicer和βactin水平。**C、。**用PMA/IM处理JAR细胞（500ng/mL PMA处理4小时，然后添加10mM IM处理24小时）。收集蛋白质并通过western blotting分析Dicer和βactin水平。

**图5。Toll样受体和干扰素对Dicer表达的影响**
A类用TLR3配体poly I:C（2mg/mL，24小时）和多重TLR刺激产生的IFN-α（1000U/mL，72小时）处理JAR细胞。收集蛋白质并通过western blotting分析Dicer和βactin水平。B类JAR细胞也用500U/mL IFN-γ处理24小时，以与IFN-α结果进行比较。收集蛋白质并通过western blotting分析Dicer和βactin水平。在HeLa细胞中观察到与上述结果类似的结果（数据未显示）。

**图6。JAR滋养层细胞中Dicer蛋白水平受细胞应激的选择性调节**
指定处理的单个JAR全细胞提取物（1000U/mL IFN-α72小时，50nM TSA 24小时，250μM H₂哦₂用western blotting分析Dicer、Argonaute 1、TTP、Hsp90、Calpain、Mad 1、GAPDH和βactin。结果代表了三个独立的实验。

**图7。细胞凋亡与IFN-α治疗Dicer的下调无关**
用1000U/mL IFN-α处理JAR细胞72小时。对于阳性对照，用250μM H₂哦₂15分钟。**答：。**通过Annexin V表面染色分析处理细胞是否存在凋亡细胞。用Annexin V-FITC对处理过的JAR培养物进行染色（见材料和方法）。在单细胞门控后，根据未处理的细胞设置标记，并测定Annexin V染色的细胞百分比。B。通过SDS-PAGE和western blotting分析Dicer、Caspase-3、Caspase8和βactin的凋亡信号级联激活。

**图8。小鼠和人类新鲜组织中Dicer蛋白水平**
**答：。**将C57BL/6小鼠脾细胞与100U/mL IFN-γ培养24小时或1000U/mL干扰素-α培养72小时。通过SDS-PAGE和western blotting分析Dicer和βactin的蛋白质。B类分离新鲜C57BL/6肾脏并培养72小时。然后用1000U/mL IFN-α处理培养物72小时，然后制备全细胞裂解液并进行western分析。C类培养正常人肾细胞（获得IRB批准作为病理后多余组织检查），用500U/mL IFN-γ处理24小时或10000U/mL干扰素-α处理72小时。用SDS-PAGE和western blotting分析蛋白质。

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