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.2009年1月；119(1):213-24.
doi:10.1172/JCI36940。 Epub 2008年12月22日。

上皮细胞α3beta1整合素连接β-catenin和Smad信号，促进肌成纤维细胞形成和肺纤维化

凯文·金 1, 英伟, 查尔斯·塞克斯, 马提亚斯·库格勒, 保罗·J·沃尔特斯, 马拉·L·希尔, 詹姆斯·弗兰克, 亚历克西斯·N·布伦威尔, 莎拉·惠勒, 乔丹·A·克利德伯格, 哈罗德·查普曼
附属公司

上皮细胞α3beta1整合素连接β-catenin和Smad信号，促进肌成纤维细胞形成和肺纤维化

凯文·金等。 临床研究杂志. 2009年1月.

摘要

肺纤维化，特别是特发性肺纤维化（IPF），是由异常伤口愈合和瘢痕化引起的。一组参与纤维化过程的成纤维细胞被认为通过上皮-间充质转化（EMT）来源于肺上皮细胞。事实上，肺泡上皮细胞（AECs）在实验性纤维化期间在体内经历EMT，在体外对TGF-β1作出反应。由于ECM严重调节AEC对TGF-β1的反应，我们通过产生肺上皮细胞特异性α3整合素表达缺失的小鼠，探讨了显著的上皮整合素α3β1在实验性纤维化中的作用。这些小鼠对博莱霉素损伤有正常的急性反应，但它们的肺肌成纤维细胞和I型胶原的积累明显减少，并且没有进展为纤维化。通过β-catenin的信号转导与EMT有关；我们发现，在原发性AEC中，α3整合素是在博莱霉素损伤后纤维化阶段体外和体内β-catenin酪氨酸残基654（Y654）磷酸化、pY654-beta-catenin/pSmad2复合物形成和EMT启动所必需的。最后，对IPF患者肺组织的分析显示存在pY654-beta-catenin/pSmad2复合物，并显示pY654-beta-catanin在肌成纤维细胞中积聚。这些发现证明了β-catenin和Smad信号之间的上皮整合素依赖性纤维化前相互作用，并支持EMT是病理性纤维化的重要因素的假设。

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数字

图1
图1。FASC小鼠肺上皮细胞特异性α3整合素丢失。
(A类)在三重转基因FASC小鼠中，rtTA使用人SPC启动子在肺上皮细胞中表达。在强力霉素（doxycycline，dox）存在下，rtTA是一种活性转录因子，导致Cre重组酶的表达和α3整合素基因的漂浮外显子3的去除，导致肺上皮细胞特异性α3整合素的丢失(B)使用包含漂浮的α3整合素基因漂浮区域的引物进行PCR。喂食多西环素的FASC小鼠肺部DNA显示出一条1-kb的条带，该条带与重组的α3整合素漂浮物相一致，另一条3.5-kb的带与肺非上皮细胞中的非重组漂浮物α3整合素对应。Littermate对照小鼠和未使用强力霉素的FASC小鼠仅显示3.5-kb条带。来自漂浮的α3整合素（α3cko）小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），在体外用表达Cre（AdCre）的腺病毒处理，作为阳性对照，仅显示1-kb带。(C类)免疫印迹显示，与缺乏1个转基因的同胞对照组（Ctrl）相比，FASC小鼠肾裂解液中的α3整合素水平正常，但全肺裂解液中α3整合素减少约50%，分离AEC裂解液中约80%的α3整合素减少。(D类和E类)孤立AECs的免疫染色表明，大约60%-90%的FASC AECs(E类)与同窝对照AEC相比，α3整合素缺乏表达(D类).
图2
图2。FASC肺的基线表型。
Littermate控制(A类,C类、和E类)和FASC(B,D类、和F类)肺切片。(A类和B)H&E染色的肺切片（原始放大倍数×20）显示出类似的肺泡结构。(C类和D类)肺切片（原始放大倍数×60）免疫染色E-cadherin（E-cad，绿色）和pro-SPC（红色）显示出类似的E-cadherin染色模式，并且FASC肺中的pro-SPC阳性细胞数量增加。(E类和F类)经三色染色的肺切片（原始放大倍数×60）显示，FASC小鼠肺泡基底膜内的弥散染色增强。(G公司)免疫印迹显示，FASC肺裂解液中α3整合素的表达降低，前SPC的表达增加，IV型胶原（col IV）明显增加，层粘连蛋白5水平相似，I型胶原（col I）与对照组肺裂解液相比略有增加。
图3
图3。保存FASC小鼠的急性肺损伤反应。
(A类和B)气管内博莱霉素损伤五天后，窝友控制(A类)和FASC(B)肺切片（原始放大倍数，×20）用H&E染色，并显示FASC小鼠的炎症增加。(C类)气管内生理盐水或博莱霉素损伤5天后，同窝对照组和FASC小鼠BAL的细胞计数。与窝友对照组相比，FASC小鼠的细胞数量增加(n个=每组4-6人）。(D类)通过血管内外渗测定肺通透性125I-白蛋白进入肺部，以EVP%表示。博莱霉素损伤后5天，FASC和同窝对照小鼠表现出相似的通透性(n个=每组4人）。(E类)肺顺应性（μl/cm H2O） 由麻醉和麻痹的通气小鼠测定。博莱霉素损伤后5天，FASC和同窝对照小鼠的依从性下降。博莱霉素损伤后，FASC小鼠的依从性低于同窝对照小鼠(P（P）= 0.09;n个=每组4个）。(F类)气管内盐水或博莱霉素损伤后5天BAL的总蛋白浓度（mg/ml）。FASC和同窝对照小鼠在博莱霉素损伤后BAL蛋白也有类似的增加(n个=每组4-6人）。(G公司)博莱霉素损伤后5天，FASC小鼠和同窝对照小鼠的过量肺水（按照方法中的描述确定）增加相似(n个=每组4人）。
图4
图4。FASC小鼠对博莱霉素损伤的肌成纤维细胞聚集和I型胶原反应受损。
(A类和B)来自室友对照的肺切片（原始放大倍率，×20）(A类；Ctrl-Bleo）和FASC(B；FASC Bleo）小鼠气管内博莱霉素损伤17天后进行α-SMA免疫染色。(C类)α-SMA阳性肌成纤维细胞的定量显示，与对照组相比，FASC小鼠产生的α-SMA阴性肌成纤维纤维细胞更少。(D类和E类)缺乏3种转基因中至少1种转基因的同窝对照小鼠的肺切片（原始放大倍数，×20）(D类)和FASC小鼠(E类)在气管内注射博来霉素21天后对I型胶原进行染色。(F类)气管内注射生理盐水后21天，用免疫印迹法分析胎鼠对照组和FASC小鼠全肺裂解物中的I型胶原含量。(G公司)气管内注射生理盐水或博莱霉素21天后，对FASC或同窝对照小鼠的整个左肺进行羟脯氨酸测定。未受伤的FASC小鼠在博莱霉素损伤后羟脯氨酸水平增加，羟脯氨酸的增加减弱(n个=每组7–16人）。(H（H）)气管内注射生理盐水或博莱霉素21天后，用免疫印迹法测定FASC或窝鼠对照小鼠肺裂解物中I型胶原的相对密度。博莱霉素损伤后，FASC小鼠的I型胶原明显少于对照小鼠(n个=每组3人）。
图5
图5。气管内注射博莱霉素后，体内出现EMT。
(A类)在三重转基因小鼠中，使用人类SPC启动子在肺上皮细胞中表达rtTA。在强力霉素（doxycycline，dox）存在下，rtTA是一种活性转录因子，导致Cre重组酶的表达和ZEG等位基因漂浮部分的去除，从而导致肺上皮细胞特异性GFP的表达。(B和C类)从同窝对照制备的全肺单细胞悬浮液中筛选GFP阳性细胞时获得的密度图(B)和三重转基因(C类；气管内博莱霉素损伤17天后，ZEG/SPC-rtTA/Cre）小鼠。显示GFP阳性细胞的百分比。(D类)气管内注射生理盐水或博莱霉素后17天，从全肺单细胞悬液中分离出GFP阳性细胞ZEG/SPC-rtTA/tetO-Cre公司老鼠。免疫印迹显示博来霉素损伤小鼠上皮衍生细胞中α-SMA的从头表达和前SPC的下调。(E类–G公司)气管内盐水或博莱霉素损伤17天后，按上述方法对GFP阳性细胞进行分类，并对GFP和间充质标记物波形蛋白进行免疫染色(E类)，α-SMA(F类)，和前胶原I(G公司)在博莱霉素损伤的小鼠中，上皮衍生细胞中表达了间充质标记物，而在盐处理的小鼠中没有表达。显示了间充质标志物的GFP阳性细胞染色百分比。原始放大倍数，×60。
图6
图6。肺上皮细胞α3整合素在体内调节EMT。
(A类和B)三重转基因肺切片（原始放大倍数，×60）ZEG/SPC-rtTA/tetO-Cre公司/α三重量/重量小鼠气管内博莱霉素损伤后17天，GFP免疫染色(A类)和α-SMA(B). 箭头表示含有GFP和α-SMA的多个细胞。(C类)ZEG-FASC中共表达α-SMA的GFP阳性细胞百分比(ZEG公司/α三飞行/飞行/SPC-rtTA/tetO-Cre公司)和室友控制(ZEG公司/α三飞行/重量或α三重量/重量/SPC-rtTA/tetO-Cre公司)用生理盐水或博莱霉素注射治疗的小鼠。与FASC小鼠相比，对照小鼠在博莱霉素损伤后，共表达α-SMA和GFP的细胞显著增加(n个=每组4人）。
图7
图7。α3整合素调节体外β-catenin和pSmad2之间的联系。
(A类和B)FASC的主要AEC(B)和室友控制(A类)小鼠在Fn上培养4天，然后用阴茎倍体蛋白染色F-actin，并用DAPI（原始放大倍数×60）进行复染。对照细胞显示肌动蛋白应力纤维与间充质形态一致，而FASC AECs显示皮质肌动蛋白染色与上皮形态一致。(C类)在分离后（第0天）和在Fn涂层表面培养4天后（第4天），通过免疫印迹分析来自FASC或缺乏3个转基因中1个的同窝对照小鼠的初级AEC。FASC AECs间充质标志物I型胶原、α-SMA和波形蛋白的表达减弱。(D类)原发性AEC感染表达mycRI或GFP的慢病毒作为对照。mycRI的免疫沉淀显示α3整合素和E-cadherin共沉淀(E类)α3的AECs显示β-catenin（β-cat）和pSmad2的免疫共沉淀+/+（对照组），但不包括FASC小鼠的AEC，将其接种在Fn上4天，以激活TGF-β1（顶部印迹）。β-连环蛋白在Y654和pY654的TGF-β1依赖性酪氨酸磷酸化–β-连环蛋白/pMad2共沉淀仅在来自α3的AECs中观察到+/+小鼠（底部印迹）。(F类)原发性AECs在Fn上培养4天，然后进行α-SMA和pY654–β-catenin染色，显示β-catentin的核聚积（原始放大倍数，×40）。
图8
图8。博莱霉素损伤后小鼠肺部β-catenin和pSmad2联合免疫沉淀。
(A类)气管内注射博莱霉素或生理盐水两周后，对FASC和窝鼠对照肺进行免疫印迹和免疫沉淀分析β-catenin。博莱霉素损伤的对照小鼠表现出β-catenin/pSmad2联合免疫沉淀。(B和C类)财务会计准则委员会(C类)和室友控制(B)博莱霉素损伤后17天新鲜冰冻肺切片（原始放大倍数×60），免疫组化染色α-SMA（绿色）和pY-β-catenin（红色）。同窝对照组（而非FASC小鼠）肌成纤维细胞簇内和周围的多个细胞核染色，以检测pY–β-catenin。
图9
图9。IPF肺中的pY654–β-catenin/pSmad2复合物。
(A类)对正常人肺样本（N1–N4）和IPF肺样本（F1–F5）进行β-catenin或pY654–β-catentin的免疫印迹和免疫沉淀分析。所有IPF样本均显示pSmad2和pY–β-catenin增加。β-catenin和pY–β-catentin与pSmad2在IPF样本中共免疫沉淀，但在正常肺样本中不共免疫沉淀。(B和C类)新鲜冷冻正常(B)和IPF(C类)肺切片（原始放大倍数×20）染色，检测pY–β-catenin（红色）和α-SMA（绿色）。IPF肺中pY–β-catenin的多个细胞核染色，但正常肺中未染色。IPF肺中的肌成纤维细胞经常呈pY–β-catenin阳性。
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