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.2008年12月23日；105(51):20263-8.
doi:10.1073/pnas.0807056106。 Epub 2008年12月11日。

荧光检测单个KcsA亚基的运动揭示了协同性

里卡德·布伦克 1, 雨果·麦奎尔, 克拉克·海德, 弗朗西斯科·贝扎尼拉
附属公司

荧光检测单个KcsA亚基的运动揭示了协同性

里卡德·布伦克等人。 美国国家科学院程序. .

摘要

原核KcsA通道在螺旋束交叉处被细胞内质子门控，在细胞外选择性过滤器处失活。为了使钾离子进入中央空腔，C端跨膜螺旋必须经历构象变化。虽然四聚体通道的部分开放被认为是离子通道（包括KcsA）的亚电导水平的原因，但4个亚基的协同开放被假设为最后的开放步骤。在这项研究中，我们使用KcsA的单通道荧光光谱来直接观察每个亚基的运动以及亚基之间的时间相关性。将纯化的标记在束交叉附近C末端的KcsA通道插入到支撑脂质双层中，并用合作或独立的马尔可夫模型分析荧光痕迹。分析表明，这4个亚基并不是完全独立地运动，而是表现出一定程度的合作性。然而，这4个亚基并不是简单地在1个协同步骤中打开。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
标记TMRM的KcsA-Q119C-E71A的单通道成像(A类)视野中通道的分布（Ø≈90μm）。随着时间的推移，斑点会被光漂白，直到最后一帧(赖特)几乎完全漂白了。所示为0.75秒、24秒和60秒时使用亮场（BF）拍摄的帧(B类)强度随时间的变化在3×3像素平方区域内测量(红色盒子)围绕着点的中心。所示为pH值分别为3和7时的2条时间曲线。在左边的轨迹中，可以观察到通道活动。高强度反映了一个封闭的亚单位（4）。亚基可能独立发挥作用(绿色箭头)或合作(红箭). 在正确的微量（pH 7）中，未观察到任何活性。蓝色箭头表示漂白步骤。(C类)多重过渡步骤B类显示在扩展的时间刻度上。(D类)整个图像强度在序列前三分之一上的平均值的三维表示，从中减去图像序列最后三分之一的平均强度。斑点显示为强峰值，表明通道未在支撑双层中扩散（移动斑点将在平均值中消失，不会形成峰值）。它还表明，在录音过程中，大多数斑点都被漂白了（漂白斑点在前三分之一为阳性，但在后三分之一则为零）。
图2。
图2。
子单元计数。(A类)由于其四聚体结构，半胱氨酸修饰的KcsA可以结合多达4个巯基反应荧光团。我们分析了与观察到的漂白步骤数量有关的时间轨迹。这里显示了pH值为5时用TIR记录的3个不同的时间轨迹，以及2、3和4个漂白步骤（箭头）。(B类)G116C-E71A直方图(上部)和Q119C-E71A(下部)从时间痕迹中计算漂白步骤得到。G116C和Q119C的亚基荧光的概率分别为0.72和0.59。
图3。
图3。
打开概率直接由荧光时间轨迹确定。(A类)根据时间轨迹（BF）确定1个亚基的开放概率，考虑到封闭亚基是亮的，开放亚基是暗的。红点是单个值。平均值和SD以蓝色显示。填充符号是所有值的平均值，开放符号是校正值，排除了所有没有活动的时间痕迹（图3B类).P（P）=0.014/0.006（方差分析）。(B类)无活性斑点部分的pH依赖性。(C类)以较高的时间分辨率（分别为5和2 ms）记录图像序列（BF）。虽然信噪比下降，但没有观察到其他信息。
图4。
图4。
KcsA荧光时间轨迹的马尔可夫模型拟合。(A类)每个亚单位可能位于荧光中（闭合，红色)或非荧光（打开，蓝色)状态。漂白后，这些状态融合为漂白的非荧光状态(灰色)，我们无法再确定通道的状态。(B类)如果亚基是独立的，则单个亚基开放的速率常数乘以封闭亚基的数量，依此类推。该模型表示独立的非漂白通道。(C类)将不可逆漂白引入到模型中可得到15态模型，其中漂白亚基（灰色）具有未定义的束交叉状态。(D类)如果亚基不是独立的，我们必须引入一个额外的耦合常数（详见正文），以便漂白的亚基对荧光亚基的速率常数产生影响。(E类)根据速率常数α和β计算单个亚基的开放概率。所示为实际值（红色）和平均值±SD（蓝色填充；P（P）=0.001方差分析）。为了进行比较，给出了标有TMRM的KcsA-E71A-Q119C的信道开放概率（蓝色开放符号）。(F类)时间轨迹的马尔可夫模型拟合产生的耦合常数。所示为单个值（红色）以及平均值±SD（蓝色；负SD在对数刻度中省略）。
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