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.2009年2月；17（2）：360-8。
doi:10.1038/mt.2008.268。 Epub 2008年12月9日。

动员-竞争慢病毒载体介导的HIV-1表达的持续转录调控

安妮·玛丽·特纳 1, 贾斯汀·德拉克鲁斯, 凯文·莫里斯
附属机构

动员-竞争慢病毒载体介导的HIV-1表达的持续转录调控

Anne-Marie W Turner公司等人。 分子治疗. 2009年2月.

摘要

当前的抗HIV-1策略通过靶向病毒蛋白和RNA减少复制；同时，针对整合前病毒水平的研究较少。我们在这里表明，含有靶向人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）长末端重复序列（LTR）转录活性区域的小分子非编码RNA的动员竞争性载体可以利用整合病毒并调节HIV-1复制。HIV-1的转录沉默与沉默状态表观遗传标记的增加相关，包括组蛋白和DNA甲基化，核因子κB（NF-κB）募集的损失，并且需要Argonaute 1（Ago-1）、组蛋白脱乙酰酶1（HDAC-1）和DNA甲基转移酶3a（DNMT3a）定位到LTR。在1个月内观察到病毒的长期抑制，没有病毒耐药性的证据。这些数据表明，RNA引导的HIV-1转录沉默可以通过动员能力载体传递，这表明该系统可以用于靶向保守启动子元件的长期选择性压力，以进化出致病性较低的HIV-1变体。

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数字

<b>图1</b>
图1
动员相容性载体介导的HIV-1 LTR表达的转录沉默。(一)产生了HIV-2运动竞争性载体，以包含专门针对HIV-1b的LTR/启动子区域的各种小RNA(补充材料和方法).10(b条)LTR表达荧光素酶的转录沉默。用相应的pHIV2载体+/−Tat转染TZM-bl细胞。三倍体处理培养物的结果显示为标准偏差。(c（c）)用362as或pHIV2（对照）+/-Tat处理的TZM-bl细胞的核运行分析。三次RT-PCR反应的结果显示为平均值的标准误差。(d、 电子)在Tat存在下对载体处理的TZM-bl细胞进行染色质免疫沉淀分析(d日)Ago-1和(e（电子）)H3K27me3。三倍体处理培养物的结果显示为标准偏差。
<b>图2</b>
图2
载体治疗对HIV-1b表达的影响。(一)慢病毒载体以不同比例与HIV-1分子克隆HX10共转染三次。收集培养上清液，汇集在一起，并通过酶联免疫吸附试验检测p24的表达。测定了不同载体或病毒比例对载体动员的影响。(b条)通过qRT-PCR对来自联合转染的Shed病毒颗粒的病毒或载体进行评估。两者的比率(b条)载体/病毒的拷贝或(c（c）)显示了标准化为HIV-1 p24 pg/ml的载体/病毒比率。(d日)使用3:1载体与病毒比率转染的上清液感染Jurkat细胞，并在长达一个月的连续传代中进行p24分析。(e（电子）)连续传代第28天的上清液用于感染TZM-bl细胞，48小时后测定荧光素酶的表达。三倍体处理培养物的结果显示为标准偏差。(（f）)连续传代后第28天的上清液传至TZM-bl细胞，并对H3K27me3或NF-κB（p65）的富集进行ChIP分析，特别是在靶LTR。显示了单个实验的结果。
<b>图3</b>
图3
TZM-bl细胞中HIV-1 LTR的转录分析。(一)图中显示了原型HIV-1病毒LAI的LTR，以及用于评估LTR转录活性的各种引物集(b条)用pTatDsRed（+Tat）或对照pcDNA3.1（+）（−Tat）转染TZM-bl细胞。48小时后收集培养物，并使用各种引物集（1-4）收集和评估细胞mRNA，以确定5′LTR的相对转录。集1-4显示为RT转换（+RT）或细胞mRNA单独（−RT）。
<b>图4</b>
图4
362as治疗导致HIV-1 LTR的定向表观遗传改变。(一)247as和362as靶基因座与靶LTR一起示意性显示。2个转录起始位点，30还显示了TAGAA或TATAA、3 NF-κB、Sp1和Ap1转录因子结合位点。(b条)用362as处理TZM-bl细胞会导致靶位点NF-κB p50和p65的丢失，而对照处理的HIV-2样本则不会。(c（c）)用362as处理TZM-bl细胞会导致SP1的增加和NF-κB（p65）在靶位点相对于对照处理的HIV-2样本的丢失。显示了单个实验的结果。(d日)已知参与RNAi和/或表观遗传基因调控的各种蛋白质组分的表达水平被RNAi抑制。数据表示三次转染细胞的平均敲除量，然后合并以分离总RNA(e（电子）)362as介导的LTR基因表达转录沉默需要DNMT3a、Ago-1和HDAC-1。显示了经三倍处理的培养物的平均值，以及每个处理的平均值相对于对照处理培养物的标准误差。(（f）)用362as处理培养物，使DNMT3a和HDAC-1在目标LTR位点富集。重复处理培养物的结果显示了各自的范围。(克)用362as处理培养物，与对照处理培养物相比，靶位点的DNA甲基化富集，这是通过对反标记（第一IP）洗脱样品的亚硫酸氢序列分析确定的，如e（电子）.
<b>图5</b>
图5
362as介导的HIV-1基因表达转录控制模型。(一)一旦整合到目标细胞的基因组中，运动竞争性载体可以(b条)表达一个小的非编码RNA(c（c）)直接与Ago-1相互作用并定位到伸长的转录本(d日)它包含小的非编码RNA的靶位点。小的非代码RNA和Ago-1也可能定位于DNMT3a、HDAC-1和可能的Ezh2的靶位点上。这种复合物定位于靶启动子的结果是组蛋白、DNA甲基化和转录基因沉默。
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