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.2008年12月1:3:18。
doi:10.1186/1750-2187-3-18。

二甲双胍治疗的乳腺癌细胞的细胞周期阻滞涉及AMPK的激活、细胞周期蛋白D1的下调，并需要p27Kip1或p21Cip1

永贤庄 1, W Keith Miskimins女士
附属公司

二甲双胍治疗的乳腺癌细胞的细胞周期阻滞涉及AMPK的激活、细胞周期蛋白D1的下调，并需要p27Kip1或p21Cip1

永贤庄等。 J Mol信号. .

摘要

背景：降糖药二甲双胍可能对癌症的预防和治疗具有有益的作用。众所周知，二甲双胍可激活AMP-活化蛋白激酶（AMPK）。它还被证明抑制一些培养的癌细胞的cyclin D1表达和增殖。然而，二甲双胍介导细胞周期阻滞的作用机制尚不完全清楚。

结果：在这项研究中，二甲双胍被发现可以抑制大多数培养的乳腺癌细胞系的增殖。这与雌激素受体、HER2或p53状态无关。细胞增殖抑制与细胞周期G0/G1期内的阻滞有关。与之前的研究一样，二甲双胍治疗导致（AMPK）激活和细胞周期蛋白D1下调。然而，这些事件不足以阻止细胞周期，因为它们也在MDA-MB-231细胞系中观察到，该细胞系对二甲双胍的生长抑制不敏感。在敏感的乳腺癌细胞系中，细胞周期蛋白D1的减少导致隔离的CDK抑制剂p27Kip1和p21Cip1的释放，并且这些抑制剂与细胞周期蛋白E/CDK2复合物相关。二甲双胍耐药细胞株MDA-MB-231表达的p27Kip1和p21Cip1水平显著低于二甲双胍胺敏感细胞株MCF7。当p27Kip1或p21Cip1在MDA-MB-231中过度表达时，细胞对二甲双胍引起的细胞周期阻滞变得敏感。

结论：二甲双胍引起的细胞周期阻滞除了AMPK激活和细胞周期蛋白D1下调外，还需要CDK抑制剂。这很有趣，因为许多癌症与CDK抑制剂的丢失或下调有关，其结果可能与针对AMPK通路的抗肿瘤试剂的开发有关。

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数字

图1
图1
二甲双胍抑制培养的乳腺癌细胞增殖.一MCF7细胞在指定浓度下用二甲双胍处理一天，然后用血细胞仪测定细胞数量。显示了3种独立培养物的平均细胞数。误差线表示标准偏差。通过t检验，所有治疗组与对照组的P值均小于0.01，差异显著。B类用8 mM二甲双胍治疗6种不同的乳腺癌细胞系。在指定时间，用血细胞仪测定活细胞数。每个细胞系都显示了雌激素受体（ER）表达、HER2扩增和p53表达（野生型、WT或突变型、mt）的报告状态。HER2+表示HER2扩增，而HER2-表示正常的HER2表达。数据点表示来自3个独立培养基的平均细胞数，误差条表示标准偏差。
图2
图2
二甲双胍对MCF7细胞周期进程和细胞周期调控蛋白的影响.一未处理的细胞（Con）或用8 mM二甲双胍处理1.5天的细胞（Met）用碘化丙啶染色，然后用流式细胞仪分析，以估计细胞周期每个阶段的细胞数量。实验重复3次，每个细胞相的平均误差和标准误差如表所示。B类使用识别所示细胞周期调节蛋白的抗体，通过免疫印迹法分析未处理细胞（Con）或二甲双胍处理1.5天的细胞（Met）中等量的蛋白质。β-肌动蛋白被检测为负荷对照C类从未经处理的细胞（C）或用二甲双胍（8 mM）处理1.5天的细胞（M）中分离出总RNA，并进行RNase保护分析，以检测编码所示细胞周期蛋白的mRNA（左侧面板）。使用L32 mRNA水平对细胞周期蛋白D1 mRNA水平进行标准化（右侧面板）。显示了3个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。在t检验中，二甲双胍处理的细胞的值与对照组显著不同，P值为0.006。D类使用（Met）或不使用（Con）二甲双胍（8 mM）处理MCF7细胞，然后使用对照抗体（C）或抗CDK2抗体（CDK2）制备提取物用于免疫沉淀（IP）。免疫沉淀蛋白用识别CDK2、p27的抗体进行免疫印迹分析基普1或第21页Cip1号机组如右图所示。
图3
图3
细胞周期蛋白D1的下调对应于AMP活化蛋白激酶的激活.一用（Met）或不使用（Con）二甲双胍处理MCF7细胞1.5天，然后进行western blotting检测活性磷酸-AMPK、cyclin D1和β-actin。B类MCF7细胞用抗霉素A（AM，1μM）、AICAR（4 mM）或二甲双胍（8 mM）处理1.5天。对照细胞（Con）用每种试剂的适当载体处理。Western blotting检测活性磷酸-AMPK、细胞周期蛋白D1和β-肌动蛋白。C类MCF7细胞用二甲基亚砜（载体）或AMPK特异性抑制剂化合物C（20μM）预处理1天，然后用（二甲双胍）或不使用（Con）二甲双胍的药物处理1.5天。Western blotting检测细胞周期蛋白D1或磷酸化形式的AMPK底物ACC。β-肌动蛋白作为负荷对照。
图4
图4
p27过度表达基普1在二甲双胍耐药的MDA-MB-231细胞系中导致二甲双胍的敏感性.一用（Met）和不使用（Con）二甲双胍（8 mM）处理MCF7和MDA-MB-231细胞2天。Western blotting检测磷酸化AMPK、总AMPK和p27基普1，和β-肌动蛋白。（右侧面板）与A相同，但细胞提取物用于检测磷酸核糖核酸（丝氨酸795）、细胞周期蛋白D1或β-肌动蛋白。B类.未经处理的MCF7和MDA-MB-231细胞的提取物用于p27的western印迹基普1，第21页Cip1号机组和β-肌动蛋白。C类用编码p27的构建物稳定转染MDA-MB-231细胞基普1用蛋白C表位标记以衍生细胞株MDA-MB-231WTp27。从亲本细胞系（231）和稳定转染细胞系（311WTp27）中提取的提取物用于免疫印迹检测表位标记的p27基普1（抗蛋白C表位），p27Kip1基因（第27页）和β-肌动蛋白。D类使用（虚线）或不使用（实线）二甲双胍（8 mM）处理MDA-MB-231细胞或MDA-MB231WTp27细胞长达3天。在指定的时间点，使用血细胞仪测定细胞数量。每个数据点表示来自3个独立培养基的平均细胞数，误差条表示标准偏差。E类用编码p21的构建物瞬时转染MDA-MB-231细胞Cip1号机组或空向量。然后用二甲双胍对其进行指定时间的治疗，并按照D中的描述测定细胞数量。
图5
图5
二甲双胍介导细胞周期阻滞机制的拟议模型二甲双胍治疗导致AMPK激活，从而导致细胞周期蛋白D1 mRNA的丢失和细胞周期蛋白D_1蛋白的下调。细胞周期蛋白D1的减少导致隔离的细胞周期抑制剂p27的释放基普1和第21页Cip1号机组释放的CDK抑制剂结合并抑制细胞周期蛋白E/CDK2，从而阻止细胞周期从G1期进展到S期。在二甲双胍耐药的MDA-MB-231细胞中，CDK抑制剂的水平不足以阻断CDK2，即使AMPK是活性的，而细胞周期蛋白D1是下调的。
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