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.2008年11月；4（11）：e1000287。
doi:10.1371/journal.pgen.1000287。 Epub 2008年11月28日。

体外人类性状的遗传分析：淋巴母细胞系的药物反应和基因表达

埃德温·蔡 1, 罗曼·耶伦斯基, 萨沙·博纳克达尔, 罗伯特·普伦奇, 里查·萨克塞纳, 菲利普·德贾格尔, 斯坦利·Y·肖, 卡拉·S·沃尔夫什, 杰奎琳·斯拉维克, 克里斯·科萨帕斯, 曼努埃尔·里瓦斯, Emmanouil T Dermitzakis公司, 艾伦·卡希尔·麦克法兰, 埃利奥特·基夫, 大卫·哈夫勒, 马克·J·戴利, 大卫·阿特舒勒
附属公司

体外人类性状的遗传分析：淋巴母细胞系的药物反应和基因表达

埃德温·蔡等。 公共科学图书馆-基因. 2008年11月.

摘要

最初作为DNA可再生来源收集的淋巴母细胞系（LCL）现在被用作研究人类细胞基因型-表型关系的模型系统，包括搜索影响单个mRNA水平以及药物和辐射反应的QTL。在尝试使用国际HapMap项目中的269个LCL绘制药物反应基因的过程中，我们评估了生物噪声和非遗传混杂因素对LCL性状变异的影响程度。虽然在给定的一天可以很好地测量药物反应，但我们观察到显著的日常变化性和与非遗传混杂因素的实质性相关性，例如基线生长率和培养中的代谢状态。在校正了这些混杂因素后，我们无法检测到任何对药物反应具有全基因组意义的QTL。mRNA水平的变异比例可能归因于非遗传因素（个体内变异——即生物噪声、用于转化细胞的EBV病毒水平、ATP水平），而不是可检测的eQTL。最后，为了提高功效，我们重点分析了那些既有可检测eQTL又与药物反应相关的基因；我们无法检测到eQTL单核苷酸多态性与模型中药物反应有令人信服的相关性的证据。虽然LCL是一种很有希望的药物遗传学实验模型，但生物噪声和体外伪影可能会降低功率，并有可能因混淆而产生虚假关联。

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数字

图1
图1。影响淋巴母细胞系的遗传和非遗传因素是理解人类生理学的模型系统。
图2
图2。药物反应与多种药物、生长速度和细胞系的ATP基线水平相关。
（A） 按照方法中的描述计算每个个体的相对药物反应，以获得每天对每种药物的细胞系反应的单个数字摘要。黑色圆圈表示单个细胞系对第一天测定的6MP的相对反应，与第二天测定的6MP相对反应相比较。红色圆圈同样表示对6MP的相对反应，与MTX的相对反应进行对比，这两种反应均在第一天进行分析。绿色圆圈表示6MP的相对反应与5FU的相对反应，同样在第一天进行分析。直线代表三种比较中每一种的回归，表明相对药物反应不仅是一个可重复的特征，而且可以在多种药物之间进行关联。（B） 使用Watters等人公开的在线数据，使用427名无缺失数据的个体计算多西紫杉醇和5FU的相对药物反应，以获得每个个体中每种药物的单个数字，如（a）所示。对多西紫杉醇的反应与每个个体的5FU进行对比。该线表示比较的回归，并表明（A）中观察到的效果不仅限于我们的实验，也不限于我们尝试的特定药物。（C） 按照方法中的描述估算每个个体细胞系的基线生长率。该增长率根据6MP（黑色）、MTX（红色）和5FU（绿色）的相对响应绘制。直线代表了各自比较的回归，所有直线都对应着显著的相关性。（D） 在药物反应分析中，使用Celtite glo在模拟处理的微孔中测量每个个体的基线ATP水平。计算EC50反应，校正生长速度（见方法）。根据MTX（红色）和5FU（绿色）的生长率校正EC50绘制相对ATP水平。直线表示比较的回归，并表示显著的相关性。
图3
图3。RNA表达的生物变异。
在Broad Institute的两个独立实验中，在Affymetrix平台上对49名无关个体进行了全基因组RNA分析。（同平台生物复制）在Illumina平台上的WTSI中也独立分析了14个子集（49个子集）（跨平台生物复制），在Affymetrix平台上的Broad Institute中再次分析了该RNA的等分试样（“WTSI RNA”）。（跨平台技术复制）（A）所有3538个表达基因的表达值在两个Broad Institute生物复制实验中的14个无关个体中的每个个体中进行排名，并在以下个体之间进行排名比较：两个单独实验中的相同个体（黑色）；两个实验中的所有无关个体对（红色）；5只黑猩猩在第一次实验中进行了检测，所有个体在第二次实验中（蓝色）进行了检测。图中显示总体的LCL中的表达谱在生物复制品之间、无关个体之间，甚至在物种之间都非常相似。（B） 在第一次Broad实验中，根据每个基因的相对水平对49名受试者进行了排名。然后，在第二次布罗德实验中独立重复该排名。对每个基因的两个实验的等级进行了比较，结果用（绿色）表示，分布的中位数用（绿色点）表示。绘图显示，当检查任何给定的基因时个人在两个独立的实验之间，尽管基因高度稳定，如（A）所示。浅黑色和红色线条与（A）相同，以便于比较。（C） 在14个个体的集合中，计算了（B）中的全基因等级比较：在Illumina平台上分析的WTSI RNA与在Affymetrix平台上测试的WTSI RNA（纯金和虚线）；在Illumina平台上测定的WTSI RNA与第一次实验期间在Broad Institute提取的RNA进行比较，并在Affymetrix平台上测定（棕色固体和点状）；两个独立的Broad实验，如（B），（绿色实线和虚线）。图中显示了大量生物学的重复分析实验时，任何给定基因的相对水平的变化，远远超出了仅测量误差的预期。洋红色破折号表示在（D）中使用的1000个“技术上最好测量的”基因的截止值。（D） 对（C）中棕色和绿色曲线的分析仅针对1000个“最佳测量”基因重复，并分别以洋红和青色绘制。曲线图表明，即使测量噪声是有限的，基因表达中的很大一部分变异也代表了生物噪声。
图4
图4。RNA表达与SNP和细胞特性相关。
198名无关个体是在Broad Institute的Affymetrix平台（“Broad RNA”）和WTSI的Illumina平台上独立分析的全基因组RNA（“WTSI RNA”）。图3中确定的1000个“最佳测量”基因与SNP和细胞特征的相关性进行了测试。（A） 对于每个测试基因，广谱RNA表达水平与EBV拷贝数相关，如定量PCR所测定。相关性表示为rho2和代表rho分布的曲线2绘制值。绿色曲线是观察到的EBV-RNA相关性分布。红色曲线代表20个置换分布。蓝色曲线是置换分布的平均值。黑色曲线是观察值和置换值之间的差异，因此是在给定rho下与EBV相关的基因比例的下限（见方法）2图中显示，约15%的表达基因的表达（秩）方差>5%，由EBV水平解释。（B） 对于每个测试基因，Broad RNA表达水平与通过在药物反应分析中测量模拟处理孔中的Celtite glo而确定的基线ATP水平相关。代表rho分布的曲线2如（A）所示，对测试基因的值进行绘图。绘图显示，>25%的表达基因的表达方差>5%，由ATP水平解释。（C） 对于每个测试基因，使用HapMap II期数据，在基因周围0.15 Mb的窗口内，Broad RNA表达水平与MAF>10%的所有SNP相关。代表最大r分布的曲线2每个测试基因的值如（A）所示。曲线图显示，在Broad RNA数据集中，>9%的基因的表达差异>5%，由SNP解释。（D） 对于每个测试基因，使用HapMap II期数据，Sanger RNA表达水平与基因周围0.15 Mb窗口内MAF>10%的所有SNP相关。代表最强r分布的曲线2如（C）中所示，绘制每个测试基因的值。曲线图显示，WTSI RNA数据集中的SNP解释了20%以上的基因的表达差异>5%。（E） 对于每个测试基因，Broad RNA表达水平与EBV、生长速度和相对ATP相关，并且绘制了3种表型之间的最强相关性。引人注目的是，该图显示，>40%的基因的表达方差>5%，由其中一个协变量解释。（F） 对于每个测试基因，WTSI RNA表达水平与EBV、生长速度和相对ATP相关，并且绘制了3种表型之间的最强相关性。引人注目的是，该图显示，即使在观察一个完全独立的表达实验时，（E）中的协变量的影响也是可以观察到的，该实验独立于协变量收集。
图5
图5。eQTL、EBV和ATP与RNA表达水平的诱导间和诱导内变异的相关性，以及RNA表达水平与药物反应的诱导间或诱导内变异之间的相关性。
使用布罗德研究所在Affymetrix平台上两次测量的49个无关个体的表达数据，将1000个“最佳测量”基因中每个基因的总方差分为个体间和个体内方差分量（见方法）。（A） 在WTSI数据集中选择了95个eQTL解释了>10%表达方差（FDR<10%）的基因（以最大化eQTL-检测能力），并将SNP基因型纳入基因的方差分量模型以“解释”其影响为每个基因绘制每个方差分量变化的1倍。正如预期的那样，该图显示SNP（在实验中保持不变）只解释了表达的诱导间变异。灰色虚线表示在置换数据集上重复整个分析时，方差分量变化估计值分布的内部和内部分别为2.5%和97.5%。（B） 125个与rho处EBV相关的基因2>选择0.05（FDR<10%），并将EBV测量值纳入基因的方差分量模型中，以“解释”其影响为每个基因绘制每个方差分量变化的1倍。该图显示，EBV与实验期间持续存在的基因表达的诱导间差异、实验间基因表达的诱发内波动或两者相关，具体取决于所讨论的基因。灰色虚线如（A）所示。（C） 249个与rho处ATP相关的基因2>选择0.05（FDR<10%），并将ATP测量值纳入基因的方差分量模型中，以“解释”其影响为每个基因绘制每个方差分量变化的1倍。该图表明，ATP与实验期间持续存在的基因表达的诱导间差异、实验间基因表达的诱发内波动或两者相关，具体取决于所讨论的基因。灰色虚线如（A）所示。（D） 202个“药物反应相关”基因的定义如图6所示。将每个基因的表达纳入指定药物反应EC50的方差成分模型中，以检查基因与其最强相关药物的相关性每个基因的药物反应方差分量变化的1倍被绘制出来，表明它主要是埋-与细胞系药物反应相关的基因表达的个体差异。灰色虚线如（A）所示。
图6
图6。药物应答相关基因中的顺-eQTL对药物应答的影响。
根据1000个“最佳测量”基因中每一个的RNA表达值，对198名无关个体进行了排名。然后根据对5种受试药物的反应（生长/ATP校正EC50）对这些个体进行排序。计算每个基因-X药物对（1000×5）的秩相关（spearman’s rho），并将与给定基因相关性最强的药物“分配”给该基因。202个与药物相关性最强的基因超过rho2 = .05（FDR<10%）作为“药物反应相关”基因。如果这样的基因也有一个解释了至少8%（FDR<10%）其方差的顺-eQTL，则在上述小组中考虑了SNP-RNA-Drug关系。我们考虑了23个SNP-RNA-药物反应关系（14个是使用WTSI RNA数据集推导的，9个是使用Broad Institute RNA数据集导出的）。（A） SNP、RNA水平和药物反应之间的不同关系图。编码SNP通过改变蛋白质功能对药物反应产生直接（非RNA介导）影响。在我们的GWAS扫描中未发现具有全基因组意义的此类SNP。RNA的变化A类影响药物反应。这些RNA之一的eQTLA类)因此与药物反应有关。非遗传混杂因素同时影响RNAB类水平和药物反应；RNA的变化B类不影响药物反应（这是大多数RNA的预期情况）。即使这些RNA水平与eQTL相关，这些eQTLs也与药物反应无关。（B） 对于每个SNP-RNA-药物反应关系（WTSI-红色，宽-绿色），药物反应与eQTL SNP基因型进行回归。在零分布下，P值被绘制为与预期相反的开放圆。黑色实线表示空值下预期的理论平坦均匀分布，黑色虚线表示偏离空值的p=.05单侧显著性阈值。灰线显示等效的零参数，但来自模拟数据集，该数据集具有与实际23个SNP-RNA-Drug应答关系相同的SNP/RNA/Drug方差和独立的SNP-RNA/RNA-Drag成对协方差。曲线图显示，观察到的药物反应的p值分布与RNA eQTL SNPs回归，超出了偶然的预期。（C） 对于每个SNP-RNA-Drug应答关系，模拟数据集的SNP/RNA/Drug方差和RNA-Drag成对协方差与实际的23个SNP-RNA-Drug响应关系相同，但实际的SNP-RNA协方差被r替代2 = 0.05. 然后，只有那些观察到的SNP-RNA关联超过r的模拟2 = 0.08用于绘制中位数和p=0.05 SNP-药物p值分布，如（B）所示（同样，分别为灰色实线和灰色虚线）。黑线也如（B）所示。曲线图显示，在没有RNA对药物反应的影响的情况下，eQTL发现中的“赢家诅咒”导致SNP-Drug协会的膨胀。（D） 对于每个SNP-RNA-药物反应关系（WTSI-红色，宽-绿色），根据SNP和药物之间的相关性绘制SNP和RNA之间的相关性。SNP与药物应答之间增加的相关性大多来自较弱的eQTL，而大多数较强的eQtl与药物应答无关，这与（C）中显示的赢家诅咒现象一致。此外，出现了3种SNP-RNA-药物反应关系，它们都是相对较强的SNP-RNA和SNP-药物反应关联，如淡蓝色箭头所示。
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