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.2008年12月；118(12):3930-42.
doi:10.1172/JCI36843。 Epub 2008年11月20日。

靶向乳酸燃料呼吸选择性杀伤小鼠缺氧肿瘤细胞

皮埃尔·松福 1, 弗雷德·里克·维格兰（Frédérique Végran）, 蒂斯·施罗德, 梅兰妮·C·沃金, 朱利安·弗拉克斯, 扎希德·拉巴尼, 克里斯托夫·德·赛德勒, 凯利·肯尼迪, 卡罗琳·迪帕特, Bénédicte F约旦, 迈克尔·凯利, 伯纳德·加雷斯, 米里亚姆·L·瓦尔, 奥利维尔·费隆, 马克·W·德赫斯特
附属公司

靶向乳酸燃料呼吸选择性杀伤小鼠缺氧肿瘤细胞

皮埃尔·松福等。 临床研究杂志. 2008年12月.

摘要

肿瘤包含氧合区和缺氧区，因此肿瘤细胞群是异质的。低氧肿瘤细胞主要利用葡萄糖产生糖酵解能量并释放乳酸，从而产生反映肿瘤中氧梯度的乳酸梯度。相比之下，有氧肿瘤细胞被认为主要利用葡萄糖产生氧化能。虽然乳酸通常被认为是一种废物，但我们现在证明，它是一种显著的底物，可以促进氧化肿瘤细胞的氧化代谢。因此，糖酵解和氧化肿瘤细胞相互调节其对能量代谢产物的获取，这是一种共生关系。我们确定单羧酸转运体1（MCT1）是人类宫颈鳞癌细胞系摄取乳酸的主要途径，该细胞系优先利用乳酸进行氧化代谢。用α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHC）或siRNA抑制这些细胞中的MCT1，可诱导从乳酸呼吸转换为糖酵解。在小鼠肺癌模型和异种移植的人类大肠腺癌细胞中，在给予CHC后，观察到氧化肿瘤细胞从乳酸燃料呼吸到糖酵解的类似转变。这延缓了肿瘤生长，因为缺氧/糖酵解肿瘤细胞死于葡萄糖饥饿，并使剩余细胞对辐射敏感。由于MCT1被发现由一系列人类原发肿瘤表达，我们认为MCT1抑制具有临床抗肿瘤潜力。

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数字

图6
图6。MCT1抑制延迟肿瘤生长，诱导肿瘤核心坏死，并减少肿瘤缺氧。
(A类)MCT1在小鼠LLc细胞的质膜上表达。典型图片显示培养细胞中MCT1（红色）和细胞核（蓝色）的荧光染色。(B类)从第0天起，在每天服用CHC（200μl i.p.中25μmol）或溶媒的小鼠组中测定LLc肿瘤生长。n个=11–17. (C类)治疗后大小匹配肿瘤活检的代表性H&E染色。虚线表示坏死（n）。(D类)MCT1在小鼠TLT细胞的质膜上不表达。典型图片显示培养细胞中MCT1（红色）和细胞核（蓝色）的荧光染色。(E类)进行了类似的分析，如B类，但使用TLT细胞。n个=6. (F类)进行了类似的分析，如A类，但使用WiDr人类大肠腺癌细胞。(克)进行了类似的分析，如B类，但在无性系Balb/C小鼠中使用WiDr细胞。n个=9–15. (H（H）)在肿瘤生长延迟试验结束时，WiDr肿瘤活检组织的典型组织学图片显示为H&E复染。上图：对整个肿瘤切片的分析显示，使用MCT1抑制剂治疗的动物的肿瘤核心广泛坏死。底部：MCT1抑制减少了小动脉周围和肿瘤周围肿瘤-肌肉界面的肿瘤缺氧。比例尺：20μm(A类,D类、和F类); 200微米(C类和H（H）). 误差条代表SEM。
图9
图9。MCT1在多种不同的人类肿瘤细胞系和原始人类肿瘤活检中表达。
(A类和B类)western blot检测MCT1(A类)和共焦显微镜(B类)在人类肿瘤细胞系和对照组织中。注意在WiDr、FaDu、SiHa和PC-3癌细胞中乳酸转运体的质膜表达。(C类)在原发性人类结肠癌、乳腺癌和头颈癌的活检中，使用免疫荧光检测MCT1（红色）和细胞核（蓝色）。(D类)在一例原发性肺癌的冷冻切片中检测到MCT1和缺氧。患者在肿瘤活检前接受了EF5治疗。典型的共焦显微镜照片显示，MCT1（绿色）和低氧标记EF5（红色）的染色没有重叠。比例尺：20μm(B类); 100微米(C类和D类).
图1
图1。氧化SiHa和糖酵解WiDr肿瘤细胞系的代谢特征。
(A类)在第0天达到细胞汇合点后，用pH计测量细胞培养上清液的pH值。插图显示了典型的培养皿，其中含有汇合在酚红培养基中的WiDr和SiHa细胞**P（P）=0.0013（双向方差分析；n个=3). (B类)等量（2×107将每毫升的存活SiHa和WiDr细胞置于含有EPR氧传感器的密封管中。EPR测量结果显示存在显著差异(P（P）<0.0001）SiHa和WiDr肿瘤细胞（学生的t吨测试；n个=5–9). (C类)在时间0时，融合细胞接受含有葡萄糖和FBS的新鲜培养基。葡萄糖利用率（实线，左年轴）和细胞上清液中的乳酸浓度（虚线，右侧年axis）酶法测定。注意左侧和右侧的不同比例年轴。n个=4.误差条代表SEM，有时小于符号。
图2
图2。乳酸是氧化肿瘤细胞代谢的底物。
(A类和B类)酶分析用于测定融合细胞上清液中的葡萄糖利用率（实线）和乳酸浓度（虚线）。注意左侧和右侧的不同比例年轴输入A类。在时间0时，细胞接受含有葡萄糖、FBS和乳酸钠的新鲜培养基(A类)或含有乳酸钠但不含葡萄糖和FBS的培养基(B类).n个=4–5. (C类和D类)ρ0 SiHa和WiDr细胞是通过低剂量溴化乙锭的慢性治疗产生的。然后，从时间0开始，将细胞培养在含有葡萄糖、FBS和乳酸钠的新鲜培养基中。葡萄糖利用率（实线，左侧年轴）和融合细胞上清液中的乳酸浓度（虚线，右侧年axes）进行酶分析，比较野生型与ρ0 SiHa细胞的代谢活性(C类)野生型与ρ0 WiDr细胞(D类). 注意左侧和右侧的不同比例年轴。n个=3–5. (E类和F类)SiHa细胞对肿瘤细胞耗氧量的EPR测量(E类)和WiDr细胞(F类)在指定的实验培养基中。统计分析见表1。误差条代表SEM，有时小于符号。
图3
图3。氧化性肿瘤细胞显著表达MCT1。
(A类)qRT-PCR分析显示较高MCT1型氧化SiHa肿瘤细胞与糖酵解WiDr肿瘤细胞中mRNA表达的比较***P（P）=0.0002（学生的t吨测试；n个=8–13). (B类)qRT-PCR分析还表明氧化SiHa细胞表达较高水平的MCT1型与…相比MCT4型mRNA*P（P）=0.0116（学生的t吨测试；n个=3–13). (C类)MCT1（而非MCT4）在氧化SiHa肿瘤细胞的质膜上表达。典型的共焦照片显示培养细胞中MCT1（红色）、MCT4（红色）和细胞核（蓝色）的荧光染色。(D类)用细胞内pH传感器C.SNARF1-AM装载SiHa和WiDr细胞。在将乳酸钠添加到维持在pH 7.3的细胞培养基之前和之后，通过荧光发射测定细胞内pH。柱表示存在外源乳酸时测得的细胞内pH值与不存在外源乳酸情况下测得的胞内pH值之间的差异（Δ）。#P（P）=0.0393（学生的t吨测试；n个=4). (E类和F类)肿瘤活检的免疫组织学分析表明，MCT1在体内SiHa和WiDr肿瘤中均表达，并且MCT1表达与缺氧相互排斥。(E类)整个SiHa和WiDr肿瘤切片的代表性图片。(F类)H&E复染显示了具有代表性的图片。箭头表示WiDr肿瘤中典型的相互排斥的MCT1和吡莫硝唑染色。比例尺：20μm(C类)，0.5毫米(E类和F类). 误差条代表SEM。
图4
图4。MCT1抑制剂阻断乳酸燃料肿瘤细胞的呼吸。
(A类和B类)酶分析用于测定融合细胞上清液中的葡萄糖利用率（实线）和乳酸浓度（虚线）。请注意年轴输入A类。在时间0时，细胞接受含有葡萄糖、FBS和乳酸钠的新鲜培养基(A类)或含有乳酸钠但不含葡萄糖和FBS的培养基(B类). 在指示的位置添加MCT1抑制剂CHC。n个=4–5. (C类–E类)SiHa对肿瘤细胞耗氧量的EPR测量(C类和E类)和WiDr细胞(D类)在所指示的实验培养基中。的统计分析C类和D类如表1所示。误差条代表SEM，有时小于符号。
图5
图5。MCT1抑制可阻止乳酸燃料ATP的生成和氧化肿瘤细胞的存活。
(A类和B类)在SiHa中测定ATP含量(A类)和WiDr(B类)细胞使用生物发光分析。在指定的培养基中培养细胞*P（P）<与仅含葡萄糖的培养基相比，0.05。#P（P）<与仅含乳酸的培养基（学生的t吨测试；n个=4). (C类)用特定的MCT1 shRNA或siRNA或对照载体转染SiHa细胞，或不进行处理。在24小时恢复期后，从时间0开始在指定的培养基中培养细胞。使用NucleoCounter随时间测定细胞死亡。坡度比较：**P（P）=0.0014和***P（P）=与野生型细胞相比为0.0003；##P（P）=0.0013和###P（P）=0.0003与对照载体转染（Student’st吨测试；n个=3–7). 误差条代表SEM，有时小于符号。
图7
图7。肿瘤中基于乳酸的代谢共生的治疗靶向模型。
缺氧肿瘤细胞依靠葡萄糖和糖酵解产生能量。糖酵分解的最终产物乳酸沿着浓度梯度向血管扩散。相比之下，氧合肿瘤细胞输入乳酸（位于细胞质膜上的MCT1介导的过程）并将其氧化以产生能量。在呼吸过程中，乳酸是优先于葡萄糖的底物。因此，葡萄糖自由扩散通过含氧肿瘤细胞鞘，为远处缺氧肿瘤细胞的糖酵解提供燃料。MCT1抑制可以破坏这种代谢共生。MCT1抑制后，氧化肿瘤细胞从乳酸氧化转变为糖酵解，从而阻止足够的葡萄糖输送至糖酵化细胞，糖酵细胞因葡萄糖饥饿而死亡。这种糖酵解开关与存活肿瘤细胞的耗氧量减少有关，这是导致肿瘤pO增加的原因2因此，MCT1抑制是一种有效的抗肿瘤策略，可间接根除缺氧/糖酵解肿瘤细胞。GLUT，葡萄糖转运蛋白。
图8
图8。MCT1抑制可使肿瘤放射增敏。
LLc荷瘤小鼠从第0天开始接受CHC（每日剂量为25μmol，每次200μl i.p.）或载体（200μl）治疗，第3天接受局部放射治疗（1次剂量为6 Gy）或联合治疗。(A类)每天测定肿瘤体积。(B类)在确定肿瘤生长延迟后比较治疗效果***P（P）<0.001与6 Gy相比；###P（P）<与单用MCT1抑制剂相比，0.001（单因素方差分析；n个=6–12). 误差条代表SEM，有时小于符号。
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中的注释

  • 肿瘤代谢：癌细胞分泌和摄取乳酸。
    塞门扎GL。 塞门扎GL。 临床投资杂志。2008年12月；118(12):3835-7. doi:10.11172/JCI37373。Epub 2008年11月20日。 临床投资杂志。2008 PMID：19033652 免费PMC文章。

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