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.2008年11月17日；183(4):681-96.
doi:10.1083/jcb.200803129。 Epub 2008年11月10日。

心磷脂为线粒体上的caspase-8提供了一个重要的激活平台

弗朗索瓦·冈萨韦斯 1, 扎卡里·T·舒格, Riekelt H Houtkooper公司, 伊莱恩·德·麦肯齐, 大卫·G·布鲁克斯, 罗纳德·J·A流浪者, Patrice X Petit公司, Frédéric M Vaz餐厅, 埃亚尔·戈特利布
附属公司

心磷脂为线粒体上的caspase-8提供了一个重要的激活平台

弗朗索瓦·冈萨韦斯等。 J细胞生物学. .

摘要

心磷脂是一种线粒体特异性磷脂，与细胞凋亡密切相关。然而，迄今为止缺乏合适的细胞模型限制了对其在细胞死亡中作用的分析。心磷脂的成熟需要转氨酶tafazzin，它在人类疾病Barth综合征中发生突变。利用Barth综合征患者衍生细胞和tafazzin被敲除的HeLa细胞，我们表明，在Fas刺激的II型线粒体依赖性反应中，需要心磷脂来实现凋亡。心磷脂为caspase-8转位到线粒体膜并嵌入线粒体膜提供了一个锚定和激活平台，在线粒体膜中，心磷脂寡聚并被进一步激活，这是有效II型凋亡反应所必需的步骤。

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数字

图1。
图1。
Barth综合征衍生的淋巴母细胞对Fas诱导的凋亡具有抵抗力。（A） HPLC-MS测定的对照组（DB037）和Barth综合征衍生（DB105.2）淋巴母细胞的CL和MLCL谱。CL-i.s.和PG-i.s.分别是已知量的四肉豆蔻酰-CL和二嘧磺酰-磷酸甘油的内标。观察到的CL团簇（I–VI）为：I=64个碳原子（可能为4×16）；II=66个碳原子；III=68个碳原子；IV=70个碳原子；V=72个碳原子（可能为4×18）；VI=74个碳原子。给定簇内的每个峰代表酰基链的饱和水平，范围从0（右）到最大8（左）双键。（B和C）通过PI排除分析对照组（DB037和DB015）和Barth综合征衍生（DB105.2和DB105.3）淋巴母细胞的细胞死亡。用内源性（B）或外源性（C）凋亡刺激物处理细胞24小时；10μM足叶乙甙或25μM顺铂作为内源性刺激物，而抗Fas抗体（0.5μg/ml）或重组TNF-α（20 ng/ml）与环己酰亚胺（CHX；20μg/ml）作为外源性刺激物。（D） 用抗Fas抗体处理细胞，用FITC-膜联蛋白V染色法检测PI阴性细胞的凋亡动力学。误差线表示±标准偏差。
图2。
图2。
Tafazzin缺乏的HeLa细胞显示低CL水平，并对Fas诱导的凋亡具有抵抗力。（A） 用对照shRNA编码质粒（shCont1和2）或用塔法辛-靶向shRNA（shTaz1和2）。采用内源性塔法齐蛋白的Western blot分析来确认该蛋白的有效敲除。shTaz1R克隆是通过将tafazzin的shRNA-resistant cDNA重新导入shTaz1细胞产生的。（B） 如图1 A所示，分析shCont1、shTaz1、shTaz2和shTaz1R细胞的CL和MLCL谱。（C）用抗Fas抗体治疗48 h后，对对照、tafazzin缺乏和回复性克隆（shTaz2R）进行细胞死亡分析。（D） 在抗Fas抗体治疗后8小时，对指示细胞进行DEVDase（caspase-3样）活性检测。误差线表示±标准偏差。
图3。
图3。
Tafazzin缺乏细胞的细胞色素缺陷c（c）以及Smac/Diablo从线粒体释放以及Fas激活后胱天蛋白酶-3的激活。（A） 在未经治疗的、抗Fas抗体处理14小时（Fas）的、抗-Fas抗体和DEVD-fmk处理的细胞（FasDEVD）中监测对照组（shCont1）和tafazzin缺乏的HeLa细胞（shTaz2）的Caspase-3活性。通过Western blotting分析PARP和caspase-3裂解，这两个已知的caspase-3靶点。（B） 细胞色素c（c）在DEVD-fmk存在下用抗Fas抗体处理14h前后，用免疫染色法分析对照细胞（shCont1）和tafazzin敲除细胞（shTaz2）线粒体的释放。细胞色素的释放c（c）根据蛋白在胞浆中的扩散以及免疫染色蛋白的整体低强度（白色箭头）判断，在每个微观区域的几个细胞中都很明显。细胞色素所在的细胞c（c）保留在线粒体中（间断染色和高强度）用绿色箭头表示。DAPI染色细胞核。（C） 分析Smac/Diablo释放的细胞色素c（c）.（D）细胞色素c（c）通过Western blot分析，检测所示细胞的细胞溶质部分的释放情况，这些细胞在B.Bars中处理，10μm。
图4。
图4。
CL-deprived线粒体有效释放细胞色素c（c）以及用重组tBid蛋白处理后的Smac/Diablo。（A） 用空载体对照（EGFPN1）或编码全长Bid蛋白融合GFP（BidGFP）或融合tBid-GFP蛋白（tBidGFP）的质粒转染所示细胞。通过FACS分析GFP阳性细胞中PI排除来评估细胞死亡。误差线表示±标准偏差。（B） 细胞色素c–从对照组（DB037）或Barth综合征衍生淋巴母细胞（DB105.2和DB105.3）分离的线粒体释放试验。线粒体要么未经治疗（u），要么接受越来越多的tBid（0.05、0.1、0.2、0.5、1、5、10和50 nM）。Triton X-100被用作最大细胞色素的阳性对照c（c）释放。在所有情况下，细胞色素c（c）当线粒体用0.5 nM或更高的tBid浓度处理时，可有效释放到上清液缓冲液中。（C） 从对照转染的（shCont1）或tafazzin敲除（shTaz2）HeLa细胞中分离出线粒体，并对其进行处理（u）或增加tBid量（0.05、0.1、0.25、0.5和5 nM）。细胞色素c（c）在上清液（Sup）和细胞色素中分析Smac/Diabloc（c）分析线粒体颗粒（Mito）中的tBid（易位到线粒体）和复合物I的亚基6（作为线粒体负荷控制）。细胞色素的有效释放c（c）在tBid浓度等于0.1 nM或更高时，线粒体中的Smac/Diablo以及tBid向线粒体的移位被鉴定出来。（D和E）线粒体是从对照细胞或缺乏tafazzin的淋巴母细胞（D）或HeLa细胞（E）中分离出来的，如B和C所示，在不使用（u）或增加tBid量的情况下进行处理后，分析线粒体上的Bak寡聚化。BMH（蛋白交联剂）或DMSO（对照溶剂）在与tBid孵育后添加。在没有BMH的情况下，即使添加了最大tBid浓度，也没有观察到较高分子量形式的Bak（E，右）。星号表示Bak蛋白的多聚体。
图5。
图5。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8活性在tafazzin缺乏细胞中消失。（A） 对照淋巴母细胞（DB037，泳道1和3；DB015，泳道2和4）和Barth综合征衍生的淋巴母细胞（DB105.2，泳道5和7；DB105.3，泳道6和8）未经处理或用抗Fas抗体（Fas）处理14小时。通过蛋白质印迹分析总细胞提取物的Bid水平。在免疫印迹数字扫描后，绘制了Bid水平的强度（以肌动蛋白水平的百分比表示）（下图）。（B） 对照（shCont1）和tafazzin-knowdown（shTaz1）HeLa细胞未经处理或用抗Fas抗体处理14 h，并按A进行分析。（C）从按B处理的指示细胞中分离线粒体，并用Western blotting分析线粒体上的tBid水平。复合物I的亚单位6用作线粒体标记和负荷控制。数字扫描免疫印迹后，绘制tBid水平的强度，作为复合物I水平的百分比（底部）。（D和E）将指示的对照细胞或tafazzin缺陷细胞按A处理，并分析IETDase（caspase-8样）活性。误差线表示±标准偏差。
图6。
图6。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8处理在塔法齐蛋白缺乏细胞中有缺陷。（A） Fas介导的细胞凋亡过程中caspase-8自动处理的示意图。（B） 对照组和Barth综合征衍生的淋巴母细胞如图5A所示进行处理，并通过Western blotting分析caspase-8裂解。使用了两种不同的抗体：caspase-8的抗DED和抗p18结构域（也检测裂解的p43形式）。（C） 对照和tafazzin敲低的HeLa细胞如图所示进行处理。5B和B中一样分析胱天蛋白酶-8的切割。（D）用抗Fas抗体处理不同的HeLa衍生的克隆，如图所示处理14小时。将裂解物与生物素-VAD fmk孵育以沉淀活性胱天蛋白酶，免疫印迹法检测caspase-8活性。该图表示p43免疫印迹在总肌动蛋白水平中所占百分比的密度分析。（E） MCF-7细胞要么未经处理，要么与放线菌酮（TNF-α）或抗Fas抗体（Fas）联合使用。用抗p18抗体评估Caspase-8的处理。（F） 表达shCont1和Bcl-xL的HeLa细胞如图5B所示进行处理，caspase-8的激活通过抗DED（顶部）或抗p18（中部）抗体进行评估。
图7。
图7。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8向线粒体的移位在CL缺乏细胞中被阻断。（A） 对照组（DB015）和Barth综合征衍生的（DB105.2）淋巴母细胞未经处理或用抗Fas抗体处理24小时。分离细胞溶胶和线粒体富集组分，并使用抗DED抗体通过Western blotting分析caspase-8定位和自动处理。复合物I的亚单位6用作线粒体标记和负荷控制。（B） 按照指示处理不同的HeLa衍生克隆，并将细胞分为胞质和富含线粒体的部分。用抗p18抗体分析caspase-8裂解产物。复合物IV的亚单位4用作线粒体标记和负荷控制。（C） 从经抗Fas抗体处理的HeLa细胞中分离出线粒体。zLETD-氨基荧光素的裂解用于评估线粒体上caspase-8的活性。该图显示了实验中发射信号的相对水平，以每微克蛋白质的任意发光单位（RLU）表示。误差线表示±标准偏差。（D） 用抗Fas抗体处理HeLa细胞，然后用MIB或碱性MIB洗涤，分离出线粒体。分析每次洗涤的沉淀和上清液中的胱天蛋白酶-8（DED和p18结构域）。caspase-8的不同裂解产物如右图所示。琥珀酸脱氢酶复合物亚基B（SDHB）用作松散连接蛋白的对照，复合物I和Bak用作膜插入蛋白的对照。（E） 在zVAD-fmk存在下，从转染caspase-8–C360S–GFP的HeLa细胞中分离出线粒体。将分离的线粒体在指定浓度下进行胰蛋白酶消化。通过免疫印迹分析线粒体颗粒。（F） 用对照siRNA（scRNA）或siRNA靶向Bid（siBid）瞬时转染HeLa细胞，如图S2所示（可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200803129/DC1). 48小时后，细胞未经处理或用抗Fas抗体处理14小时。然后分离线粒体，并用抗DED抗体通过Western blotting检测caspase-8定位和自动处理。复合物I的子单元6用作加载控制。（G） 制备含有或不含CL的脂质体，并在37°C下与体外翻译的procaspase-8蛋白孵育30分钟。然后沉淀和清洗脂质体，并通过Western blotting分析caspase-8与脂质膜的结合。在与caspase-8孵育后但在沉淀前，输入通道代表20%的样品。该图显示了含有或不含CL的脂质体上不同caspase-8形式的相对强度，是三个独立实验的平均值和标准偏差。误差线表示±标准偏差。（H） 将含有CL的脂质体与caspase-8孵育，然后在结合缓冲液中或在碱性（0.1 M Na）中清洗一次2一氧化碳三pH 11.5）或高盐（1 M NaCl）缓冲液。脂质体沉淀后，用免疫印迹法检测caspase-8的水平。输入车道如G所示。
图8。
图8。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8 C360S与tBid在线粒体上共定位。（A） 用空载体（EGFPN1）或编码caspase-8–GFP融合蛋白的质粒转染父母或过表达Bcl-xL的HeLa细胞。利用PI排除法，通过FACS分析绿色细胞的存活率。误差线表示±标准偏差。（B） 所示HeLa细胞要么未经转染，要么转染了caspase-8–GFP融合蛋白。24小时后，对细胞进行裂解并分析PARP裂解（使用抗裂解PARP抗体），作为细胞死亡的指标。（C） HeLa细胞要么未经转染，要么转染所示的caspase-8–GFP蛋白。使用不同的抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8抗体检测不同caspase-8处理形式的存在。（D） 用融合到m-Cherry（C8C360S–m-Cherri）的caspase-8 C360S突变体转染对照细胞和tafazzin敲除细胞，24h后固定细胞并染色TOM20作为线粒体标记。Alexa 647结合二级抗体用于线粒体的远红外荧光检测（人工呈现为绿色）。（E） 在zVAD-fmk存在下，用C8C360S–m-Cherry和tBid-GFP转染对照HeLa细胞，16h后固定细胞并进行共聚焦显微镜分析。棒材，10μm。
图9。
图9。
线粒体外膜上的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8寡聚物。对照HeLa细胞（shCont1）未经处理或用抗Fas抗体处理14 h，在存在或不存在蛋白质交联剂（DMSO）的情况下分离线粒体。复合物I的子单元6用作加载控制。右边显示了不同的胱天蛋白酶-8寡聚物。星号表示caspase-8的多聚体分子量较高。
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