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.2008年12月4日；456(7222):667-70.
doi:10.1038/nature07460。 Epub 2008年11月9日。

核周染色体系留在维持基因组稳定性中的作用

卡里姆·梅海尔 1, 简·西巴赫, 史蒂文·普·吉吉, 达内什·莫泽德
附属公司

核周染色体系留在维持基因组稳定性中的作用

卡里姆·梅哈伊尔等人。 自然. .

摘要

重复的DNA序列构成了某些生物体基因组的一半，经常会经历同源重组。这可能导致DNA的获得或丢失导致基因组不稳定。DNA组装成沉默染色质通常被认为是一种机制，通过限制进入重组机制来确保重复稳定性。与这一观点一致的是，在芽殖酵母酿酒酵母中，高度重复的核糖体DNA（rDNA）的稳定性序列需要含有Sir2的染色质沉默复合物，该复合物还通过称为rDNA沉默的过程抑制来自插入重复序列中的外源启动子和转座子的转录。在这里，我们描述了一个蛋白质网络，它通过rDNA-相关沉默蛋白和内核膜（INM）的两个蛋白之间的相互作用来稳定芽殖酵母的rDNA重复序列。INM或沉默蛋白的缺失降低了核周rDNA定位，破坏了核仁-核质体边界，诱导重组焦点的形成，并破坏重复序列的稳定性。此外，将rDNA重复序列人工靶向INM可以抑制在缺乏rDNA-相关沉默蛋白的细胞中观察到的不稳定性，该沉默蛋白通常是重复序列的外周系留所必需的。此外，与Sir2及其相关的核仁因子相比，rDNA沉默不需要INM蛋白，这表明Sir2依赖性沉默不足以抑制rDNA位点内的重组。这些发现证明了INM蛋白在染色体核周定位中的作用，并表明rDNA重复序列的稳定性需要与核外周相连。这里研究的INM蛋白是保守的，与后生动物的染色体组织有关。因此，我们的结果揭示了INM蛋白和染色体蛋白之间的相互作用确保基因组稳定性的古老机制。

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数字

图1
图1。从rDNA延伸到核膜的蛋白质网络
一，rDNA在Chr上重复。十二、。每个单位产生一个Pol I-转录的35S前体rRNA（加工成25S、18S和5.8S）和一个Pol-III转录的5S rRNA。CEN，着丝粒；TEL，端粒；IGS，基因间间隔；RE，重组增强子；，复制叉块；TIR、Pol I转录起始区；O、 DNA复制起源；Mbp，兆字节对。垂直箭头表示的插入位置mURA3型本研究中使用的报告基因。b条G的核组织2/M细胞周期阶段。1号，核仁；ONM，外核膜。立方英尺天然复合物的纯化。c（c）,e（电子），银染色凝胶中的蛋白质检测。蛋白纯化过程中TAP的裂解留下了钙调素结合蛋白（CBP）片段。d日,（f），LC-MS/MS分析。显示了独特肽的数量以及蛋白质序列的覆盖率。SI包含完整的蛋白质列表（补充表1，A部分）和光谱计数（补充表2和3）。
图2
图2。核周蛋白网络在rDNA重复序列中的作用
一,b条，费率ADE2型相对于野生型（WT）的标记丢失（平均值±标准差）(一)和代表性殖民地(b条)如图所示。c（c），rDNA稳定性的CHEF分析。用IGS1 rDNA（Chr.XII，顶部）探测CHEF解析的染色体。溴化乙锭（EtBr）染色。IV和较小的染色体显示了准备的质量（底部）。显示了rDNA拷贝数平均值和涂片边缘对应的值。变更。XII尺寸sir2Δ异构性太强，无法估计拷贝数。d日，与Sir2和Cohibin不同，CLIP对于rDNA沉默是不可或缺的。十倍连续稀释细胞mURA3型报告基因插入IGS1/IGS2（位置见图1a）或rDNA外LEU2级轨迹如图所示。
图3
图3。蛋白质网络将rDNA连接到核膜
一双免疫荧光分析的代表性细胞3D重建揭示了Net1-GFP（绿色）和Heh1-Myc13（红色）的相对组织。Heh1-Myc13的信号边界用剪切平面表示。显示了绿色相对于全红色体积的百分比（平均值±标准差；n=5）。b条，诺可达唑（G2/M） 将细胞进行FISH以显示rDNA和DAPI染色（伪红色）以显示大量核DNA。具有不同rDNA形态的细胞由双箭头（缠绕线）、箭头（无定形）或三角形（两个实体）表示，并在补充图6b中进行量化。比例尺，3μm。c（c）对带有TetI-RFP标记rDNA并表达Rad52-YFP和核仁Nop1-CFP的活细胞进行成像。图中显示了大多数观察到的表型。补充图6d-f中提供了更多图像和量化信息。比例尺为1μm（白色）和3μm（黑色）。d日,e（电子），显示了所指示的TAP标记的蛋白质的相对倍数富集。rDNA组织示意图如图所示。凝胶d日和e（电子）分别如补充图7a和7d所示。IGS1 ChIP的详细信息如补充图7b，c所示。
图4
图4。靶向核周栓系促进rDNA重复序列稳定性
一，Heh1到Sir2的融合lrs4Δ细胞。Heh1显示嵌入在INM中。b条FISH显示，Heh1和Sir2的融合恢复了缺乏Lrs4的诺克唑滞留细胞中DAPI染色中rDNA信号的分离。比例尺，3μm。c（c），相对速率ADE2型标记丢失（平均值±标准差）。星号，学生t检验P<0.0001。d日，rDNA稳定性的CHEF分析。用IGS1 rDNA（Chr.XII，顶部）探测CHEF解析的染色体。Chr的EtBr染色。IV和较小的染色体显示了准备的质量（底部）。e（电子），将rDNA连接到核外围的核周分子网络的功能组织。INM CLIP蛋白或rDNA沉默复合物的丢失导致重复不稳定性。
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