Host cell factors and functions involved in vesicular stomatitis virus entry

doi:10.1128/JVI.01864-08

.2009年1月；83(1):440-53.

doi:10.1128/JVI.01864-08。 Epub 2008年10月29日。

水疱性口炎病毒侵入的宿主细胞因子和功能

赫夫娜·克里斯汀·约翰斯多蒂尔¹, 罗伯塔·曼奇尼, 尤尔根·卡尔滕贝克, 利亚·阿马托, 阿里·海伦纽斯

附属公司

PMID： 18971266
预防性维修识别码： PMC2612308型
内政部： 10.1128/JVI.01864-08

水疱性口炎病毒侵入的宿主细胞因子和功能

赫夫娜·克里斯汀·约翰斯多蒂尔等。 J维罗尔. 2009年1月.

.2009年1月；83(1):440-53.

doi:10.1128/JVI.01864-08。 Epub 2008年10月29日。

作者

赫夫娜·克里斯汀·约翰斯多蒂尔¹, 罗伯塔·曼奇尼, 尤尔根·卡尔滕贝克, 利亚·阿马托, 阿里·海伦纽斯

隶属关系

¹苏黎世ETH生物化学研究所，瑞士苏黎世CH-8093 Schafmattstrasse 18。

PMID： 18971266
预防性维修识别码： PMC2612308型
内政部： 10.1128/JVI.01864-08

摘要

水泡性口炎病毒（VSV）是一种基于电子显微镜的动物病毒，其对酸性细胞隔室的感染依赖性被认为以依赖于网格蛋白的方式进入宿主细胞。然而，确切的细胞机制在很大程度上是未知的。在这项研究中，我们描述了VSV的进入动力学，并阐明了病毒在HeLa细胞感染期间对宿主细胞因子的需求。我们发现，VSV的内吞是一个快速的过程，半衰期为2.5至3分钟，早期内吞体内吞后1至2分钟内发生酸活化。大多数病毒颗粒以基于网格蛋白的、依赖于动力学蛋白2的方式被内吞。虽然与一些表面结合病毒相关，但感染并不需要经典的衔接蛋白复合物AP-2。时间推移显微镜显示，病毒要么进入预先形成的氯氰菊酯涂层凹坑，要么诱导凹坑从头形成。Dynamin-2被募集到质膜限制的病毒颗粒中。因此，VSV可以通过利用与网格蛋白相关的蛋白质和细胞功能的特定组合来诱导生产性内化。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
HeLa细胞中VSV的进入动力学。（A）预绑定VSV的内部化。[³⁵S] 蛋氨酸标记的VSV在4°C时与细胞结合。去除未结合病毒，并将细胞移至37°C水浴中指定的时间。在这些实验中，发现约3500 cpm与细胞相关，超过20%的细胞相关病毒在变暖时对蛋白酶K产生抗性。通过蛋白酶K处理去除剩余的表面相关病毒后，使用闪烁计数器对内化病毒进行定量。误差条表示三个实验的平均值的标准偏差。（B） VSV酸活化和VSVG降解动力学。VSV在4°C时与细胞结合。去除未结合病毒，并将样品转移到37°C水浴中（NH₄Cl添加[钻石]）或存在（NH₄NH的Cl冲刷（圆圈）₄Cl表示指定的时间。随后，NH₄向样品中添加Cl（NH₄Cl添加[钻石]）或移除2分钟，然后读取（NH₄Cl冲刷[圆圈]）。加热4小时后，通过FACS对感染进行评分，并以不存在NH时感染细胞的百分比表示₄Cl.误差条表示三个实验的标准偏差。（C） VSVG退化。VSV在4°C时与细胞结合。去除未结合病毒，并将样品在1 mM环己酰亚胺存在下转移到37°C水浴中指定时间。随后，通过Western blot分析（B组中的三角形）量化内化未分级VSVG的数量。误差条表示三个实验平均值的标准误差。

**图2。**
与BHK-21细胞质膜相关的VSV的电子显微镜。病毒在4°C下与细胞结合1h。细胞固定并薄片分析。一些膜结合病毒与电子致密的细胞质外壳（A、B、C、D和H）有关，其他病毒呈无涂层凹痕（E、F和G）。许多接近或与微绒毛相关（A、E、F和G）。变暖后，病毒开始内化（H）。在某些情况下，在单个包被的凹坑（图C和H中的开放箭头）或包被的囊泡（图H中的闭合箭头）内可以看到多个病毒颗粒。棒材，100 nm。

**图3。**
内吞囊泡中VSV的电子显微镜观察。病毒在4°C下与BHK-21细胞结合1小时，然后将细胞转移到37°C的培养箱中，以允许内部化。病毒出现在包膜或部分包膜的内吞囊泡（B[开放箭头]和C）或相对较小、紧密贴合的内吞小泡（A和B[闭合箭头]）中，表明它们存在于早期内吞小室中。（D和E）在20 mM NH存在的情况下进行加热₄Cl允许内化，但不允许酸活化融合。病毒在较大的内体结构中积聚，一些内体结构含有内囊泡。棒材，100 nm。

**图4。**
VSV感染依赖于dynamin-2。HeLa细胞在指定浓度的dynasoter存在下感染了VSV和痘苗病毒（VV）。通过FACS检测感染并将其归一化为未经处理的细胞感染。误差条表示三个实验的标准偏差。

**图5：。**
VSV感染不依赖于AP-2。用针对AP-2α（AP2-1和AP2-2）或AP-2μ（AP2-3）的siRNA转染HeLa细胞。（A）通过Western blotting对siRNA-处理细胞中AP-2α（顶面板）和AP-2μ（底面板）蛋白水平进行定量。结果显示为用AP2-1、-2或-3 siRNA处理的细胞中AP-2水平的百分比，并将其归一化为用AllStars阴性对照siRNA处理过的对照细胞中的AP-2水平，以及用作负荷对照的肌动蛋白水平。（B）用AP2-1至AP2-3处理的细胞感染rVSV，用FACS对感染进行评分，所得值归一化为用AllStars阴性对照siRNA处理的细胞的感染水平。误差条表示三个实验的标准偏差。（C）用AP2-1、-2和-3 siRNA或AllStars阴性对照siRNA处理的细胞感染rVSV 4小时。将AF594标记的Tfn加入样品中15分钟，固定前25分钟。分别使用小鼠抗AP-2α和AP-2μ抗体以及AF647标记的二级抗体检测AP-2α及AP-2μ水平。rVSV复制后通过GFP表达检测感染。棒材，10μm。

**图6。**
VSV可以瞄准预制CCP。将AF488标记的VSV加入表达CLC-mRFP的HeLa细胞中，通过TIRFM进行活细胞成像。（A）时间序列、（B）波形图和（C）强度图显示了标记的VSV如何从周围介质中出现在TIRF场中，并与稳定的CCP共存。

**图7。**
VSV可诱导CCPs的形成。AF647标记的VSV（伪红色）和表达CLC-EGFP的HeLa细胞通过TIRFM进行活细胞成像。（A）时间序列显示了一个受限的病毒颗粒（VSV-AF647中的白色箭头）及其下方的氯氰菊酯募集（CLC-EGFP中的白色图标，VSV[w/VSV]为52秒）。病毒随后分离并重新定位（VSV-AF647中的黑色箭头在131秒时出现），随后不久，坑崩塌（CLC-EGFP w/VSV在152到163秒时发生）。病毒再次确认后（VSV-AF647中的黑箭头在131秒时出现），病毒颗粒下方出现一个新的网格蛋白包被的凹坑（CLC-EGFP中的黑箭在391秒时出现VSV）。底部一行显示了无病毒（w/o VSV）关联的CCP时间序列（CLC-EGFP中的灰色箭头，w/o VSV为95秒）。（B）与面板A中相同事件的Kymograph。白色箭头表示病毒和CLC信号在最初禁闭位置的出现和消失，黑色箭头表示第二个位置的平行事件。白色箭头（指示病毒从第一个位置消失）和黑色箭头（指示其在第二个位置出现）之间的条描述了病毒在质膜平面内运动的时间框架。（C）强度图显示了病毒颗粒（红色方块）、病毒相关的网格蛋白（绿色菱形）和病毒依赖的CCP（灰色三角形）随时间的变化。

**图8。**
Dynamin被招募到血浆膜结合VSV。AF594标记的VSV和dynamin-2-EGFP表达的HeLa细胞通过TIRFM进行活细胞成像。（A）时间序列显示一个受限的病毒粒子（VSV-AF594中的白色箭头）及其下方的动态素招募（动态素-2-EGFP中的黑色箭头，VSV[w/VSV]在68秒时出现）。随着时间的推移，动态信号变得较弱（动态-2-EGFP w/VSV，114秒），但随后强度再次增强（动态-2-EGFP，w/VSV，162秒）。底部一行显示了与VSV无关的dynamin-2-EGFP中dynamin-2-EGFP的质膜募集时间序列（114秒时无VSV[w/o VSV]）。（B）如上文所述的面板A（C）相同事件的Kymograph图。强度图显示了病毒粒子（红色方块）、相关的动态蛋白（绿色钻石）和病毒依赖的动态蛋白质膜募集（灰色三角形）随时间的变化。

**图9：。**
AP-2在质膜上与VSV共定位，但可能不会被病毒吸收。AF594标记的VSV和AP-2α-EGFP表达的HeLa细胞通过TIRFM进行活细胞成像。（A）血浆膜结合病毒（VSV-AF594中的白色箭头）的时间序列及其与AP-2α的共定位（AP-2α-EGFP中的黑色箭头与VSV[w/VSV]从63秒开始）。最低一行显示AP-2α向质膜的募集与VSV无关（AP-2α-EGFP中的灰色箭头在63秒时无VSV[w/o VSV]）。（B）时间序列中显示的相同事件的Kymograph。（C）强度图显示了病毒颗粒（红色方块）、同位化AP2α（绿色菱形）和病毒依赖性AP-2α（灰色三角形）在质膜上随时间的变化。

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