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.2008年12月12日；283(50):35106-17.
doi:10.1074/jbc。M806874200。 Epub 2008年10月21日。

C/EBP同源蛋白（CHOP）与激活转录因子4（ATF4）相互作用并负调控天冬酰胺合成酶基因的应激依赖性诱导

南苏 1, 迈克尔·基尔伯格
附属公司

C/EBP同源蛋白（CHOP）与激活转录因子4（ATF4）相互作用，负调控天冬酰胺合成酶基因的应激依赖性诱导

南苏等。 生物化学杂志. .

摘要

C/EBP同源蛋白（CHOP）是一种应激诱导的转录因子，参与转录调控、细胞周期和凋亡。本研究在酵母双杂交筛选中确定CHOP是激活转录因子（ATF）4的相互作用伙伴，并证实了它们在HEK293T细胞中的相互作用。在氨基酸缺乏期间，CHOP蛋白水平轻度短暂升高，而内质网应激导致CHOP蛋白的持续高表达。外源CHOP表达增强了氨基酸剥夺对TRB3基因的诱导。相反，CHOP抑制内源性天冬酰胺合成酶（ASNS）基因的诱导，并在ATF4或氨基酸剥夺激活后抑制ASNS启动子驱动的报告基因的转录。短干扰RNA介导的CHOP敲除进一步增强了氨基酸剥夺或内质网应激对ASNS的诱导。ASNS基因的CHOP依赖性抑制需要整个CHOP蛋白，这与CHOP亮氨酸拉链结构域简单隔离ATF4的可能性相矛盾，染色质免疫沉淀分析显示CHOP与ASNS和TRB3启动子相关。有趣的是，染色质免疫沉淀也表明CHOP与SNAT2、VEGF和CAT-1基因的C/EBP-ATF复合位点区域相关，尽管外源性CHOP过度表达后对其表达没有显著影响。总之，结果证明CHOP是转录因子网络的成员，该转录因子网络控制应激诱导的特定C/EBP-ATF基因调控，如ASNS。

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数字

图1。
图1。
酵母双杂交鉴定CHOP作为ATF4结合伙伴筛选。 A类，图显示了351个氨基酸(AA公司)组成ATF4蛋白和片段用作酵母双杂交筛选的诱饵。对于碎片点画部分指出展示的ATF4区域测试时自动激活。这个黑条（aa 270-351）英寸A类对应于基本亮氨酸拉链结构域的序列是用于获取中显示的阳性克隆B类.C类，图表显示CHOP蛋白的结构域下面的黑色条指出在酵母双杂交筛选。指示的N端（aa 1-100）和C端（aa 100-169）是CHOP片段过度表达以获得图7。
图2。
图2。
CHOP和ATF4的相互作用体内HA-ATF4和CHOP为在HEK293T细胞中单独或联合表达。全细胞提取物收集并使用HA进行免疫沉淀抗体结合琼脂糖珠。洗脱结合蛋白并进行免疫印迹分析检测ATF4和CHOP的存在(A类). 在一个交互实验，提取物进行免疫沉淀(IP（IP）)使用CHOP抗体或正常小鼠IgG抗体(IgG抗体).洗脱结合蛋白并进行免疫印迹分析以检测ATF4和CHOP的存在(B类).
图3。
图3。
CHOP对ASNS公司-HisOH激活的驱动转录或ATF4。显示结构的图表ASNS公司-173/+51启动子/荧光素酶报告子(A类).HepG2细胞联合转染0.5μg/孔ASNS公司-173/+51启动子/萤光素酶报告质粒和CHOP-pcDNA3.1表达质粒，按指示量。要激活ATF4依赖性转录，一半的细胞用2米米HisOH 12小时(B类)而另一半是与10 ng/孔ATF4-pcDNA3.1表达质粒共转染(C类). 转染DNA的总量在实验组通过添加pcDNA3.1质粒。细胞提取物按照“材料和方法。”用三个不同批次的单元格，显示的结果代表平均值±S.E。
图4。
图4。
CHOP过度表达对内源性基因表达的影响。HEK293吨用GFP-pcDNA3.1或CHOP-pcDNA3.1质粒转染细胞在“材料和方法”中进行了描述A类显示相位GFP转染细胞的对比荧光图像（2μg/60-mm盘子）。转染后24小时，细胞在MEM或MEM含2m米HisOH，然后RNA和蛋白质提取物隔离。GFP或CHOP转染细胞的蛋白提取物免疫印迹分析检测CHOP蛋白的存在(B类).对RNA进行qRT-PCR分析，以确定其mRNA含量指示基因以及GAPDH mRNA作为内部控制。结果是显示为三个独立实验的平均值±S.E(C类). 安星号表明表达的诱导CHOP表达显著改变(第页< 0.05).
图5。
图5。
氨基酸诱导CHOP表达和细胞凋亡的时间进程限制和ER应力。HepG2细胞在MEM、MEM中培养含2m米HisOH或含300 n的MEM米Tg.时间时间表明，RNA被分离并通过qRT-PCR分析CHOP或GAPDH mRNA含量(A类). 这个图表说明了三个独立实验的平均值为±S.E。在未显示的情况下误差线包含在符号。在第二个系列中在实验中，收集蛋白质提取物并进行免疫印迹ATF4、CHOP和β-肌动蛋白含量分析(B类). 显示的污点是一个单独的实验，它下面的ATF4量化表示两个独立实验的平均值。为收集数据C类,HepG2细胞在MEM中培养0-48小时，MEM含有2 m米HisOH或含300 n的MEM米Tg.在指定时间，蛋白质收集提取物并进行caspase 3的免疫印迹分析（未剥离和劈开形式）和β-肌动蛋白含量。所示污点为两个独立实验的代表。
图6。
图6。
siRNA介导的CHOP敲低对内源性CHOP的影响ASNS公司表达式。用对照siRNA或CHOP转染HepG2细胞小干扰RNA。转染后36小时，细胞在MEM中培养，MEM含有2米米HisOH或含300 n的MEM米4h总Tg分离RNA并对ASNS异核RNA进行qRT-PCR分析要评估的内容ASNS公司转录活性(A类). 这个数据表示为ASNS公司异核RNAGAPDH控制。测定CHOP mRNA和GAPDH mRNA含量(B类). 这个图表说明了三个值的平均值±S.E独立实验。蛋白质提取物进行免疫印迹CHOP和β-肌动蛋白含量分析(C类).Ctrl键,控件。
图7。
图7。
截短CHOP蛋白对转录的影响ASNS公司发起人。显示表示用V5表位标签标记的全长或截短CHOP蛋白(A类). CHOP构建物转染HEK293T细胞，12h后，对蛋白提取物进行V5标记的免疫印迹分析蛋白质与β-肌动蛋白(B类). CHOP结构还包括转染HepG2细胞ASNS公司-173/+51启动子/荧光素酶报告质粒与2米米HisOH治疗或ATF4过度表达，如所示(C类). 如前所述，对细胞提取物进行荧光素酶活性分析在“材料和方法”下。每个值代表三种分析，用两批不同的细胞重复每个实验。这个所示结果代表平均值±S.E.An星号表示该值明显不同(第页<0.05）对照组（0 ng/井CHOP）。
图8。
图8。
CHOP与含有C/EBP-ATF复合物的基因的关联网站。HepG2细胞在MEM对照培养基中培养或用2米米HisOH或300 n米Tg持续4 h。ChIP分析为按照“材料和方法”中的描述执行。DNA用CHOP抗体免疫沉淀片段，并富集使用引物集，通过qPCR分析指示基因的CHOP蛋白特定于感兴趣的地区。数据被绘制为与通过1:20稀释输入DNA获得的值。对每种情况进行了分析一式三份，每个点代表两个点的平均值±S.E独立实验。安星号表示该值为与MEM控制显著不同(第页< 0.05).
图9。
图9。
CHOP和ATF4在C/EBP-ATF复合场地的共现性。HepG2型细胞在MEM对照培养基中培养或用2米米HisOH或300 n米Tg持续4 h。双ChIP分析为按照“材料和方法”中的描述执行。DNA首先用CHOP抗体免疫沉淀片段，洗脱，然后用ATF4抗体进行第二次免疫沉淀或正常兔IgG抗体。CHOP/ATF4蛋白在基因通过qPCR进行分析，使用特定于以下区域的引物集利息。数据以1:200的比例绘制输入DNA的稀释。每个点代表三个点的平均值±S.E独立实验。安星号表示该值为与MEM对照组和IgG对照组均存在显著差异(第页< 0.05).
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