The thioredoxin system mediates redox-induced cell death in human colon cancer cells: implications for the mechanism of action of anticancer agents

doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-2010

.2008年10月15日；68(20):8269-77.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-2010。

硫氧还蛋白系统介导氧化还原诱导的人结肠癌细胞死亡：对抗癌药物作用机制的启示

于孙¹, 巴兹尔·里加

附属公司

PMID： 18922898
预防性维修识别码：项目经理3565581
内政部： 10.1158/0008-5472.CAN-08-2010年8月10日

硫氧还蛋白系统介导氧化还原诱导的人结肠癌细胞死亡：对抗癌药物作用机制的启示

于孙等。癌症研究. 2008.

.2008年10月15日；68(20):8269-77.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-2010。

作者

于孙¹, 巴兹尔·里加

附属

¹美国纽约州石溪市石溪大学癌症预防科医学系，邮编：11794-5200。

PMID： 18922898
预防性维修识别码：项目经理3565581
内政部： 10.1158/0008-5472.CAN-08-2010年8月10日

摘要

抗癌药物至少部分通过诱导活性氧和氮物种（RONS）发挥作用。我们检测了四种抗癌化合物对SW480和HT-29结肠癌细胞的氧化还原作用，即三氧化二砷、磷酸阿司匹林、磷酸舒林酸和一氧化氮供体阿司匹灵（NO-ASA）。所有化合物均抑制两种细胞系（IC（50），10-90微摩尔/升）的生长，并通过普通RONS分子探针检测到诱导的RONS。NO-ASA诱导了至少四个单独的RONS（NO、H（2）O（2）、超氧阴离子和过氧物），诱导了由RONS介导的凋亡和坏死细胞死亡（细胞死亡与RONS水平平行，被N-乙酰半胱氨酸而非二苯碘消除，二苯碘表现出促氧化活性并增强了细胞死亡）。核因子-κB和有丝分裂原活化蛋白激酶受RONS调节。硫氧还蛋白-1（Trx-1）是一种参与氧化还原调节的氧化还原酶，在RONS的作用下被严重氧化，并介导抗癌药物的生长抑制作用；通过小干扰RNA敲低trx-1表达可以消除它们诱导的细胞死亡。这些化合物还抑制了还原氧化的Trx-1的Trx还原酶的活性，而Trx还素酶抑制剂金硫苹果酸与NO-ASA协同诱导细胞死亡。我们的发现表明，Trx系统在很大程度上介导氧化还原诱导的细胞死亡，以应对抗癌药物。这种作用机制可能为更多抗癌药物所共享，值得进一步评估，作为药物控制癌症的候选机制。

PubMed免责声明

数字

**图1。抗癌药物在结肠癌细胞系中诱导多种RONS**
答：如图所示，用各种化合物处理HT-29和SW480细胞3h，然后进行DCFDA染色30min。通过流式细胞仪读取每个样品的荧光强度。B： *上部面板*将HT-29和SW480细胞与NO探针DAF-2预孵育30分钟，然后用测试剂处理3小时，此时通过流式细胞术测定细胞内NO水平，如方法中所述。结果显示，与对照细胞相比，其倍数增加。*下部面板*将HT-29和SW480细胞与H预孵育15分钟₂哦₂当细胞内h₂哦₂根据方法中的荧光测定水平。结果表示为与未经处理的对照组相比增加了一倍。**抄送：**用50μM NO-ASA（2xIC）处理HT-29细胞₅₀)30分钟，然后是5μM MitoSox( $哦_{2}^{• -}$ 探针）10分钟(*上部面板*)或5μM DHR（过氧亚硝酸盐探针）15分钟(*下部面板*). 生产 $哦_{2}^{• -}$ (*上部面板*)和过氧亚硝酸盐(*下部面板*)使用蔡司LSM510元共焦显微镜进行观察。在每个面板中，上一行表示荧光图像，下一行表示与相应的差分干涉对比度（DIC）图像合并的图像。值为*意思是*±*扫描电镜。*

**图2。NO-ASA诱导氧化应激依赖性细胞死亡**
答：用不同浓度的NO-ASA处理SW480和HT-29细胞24小时，收集细胞进行凋亡或坏死细胞死亡分析。流式细胞术测定PI掺入量检测凋亡细胞死亡（亚G₁图A左侧所示的DNA直方图中的种群）。从培养上清液中提取的LDH分析用于确定坏死，如图A右侧所示。请注意两张图之间的比例差异。B：用NAC或DPI预处理SW480细胞4小时或2小时，然后用NO-ASA处理18小时，如图所示。Annexin V和PI染色用于检测坏死和凋亡，如左边B组的等压线图*正确的*基于annexin V和PI染色的细胞死亡结果，用于分析NO-ASA和DPI对细胞死亡的潜在协同作用。加法线连接IC₅₀单独使用的每种化合物的价值。A和B代表每种化合物的两个不同剂量对（每个点显示了各自的浓度）。A和B都出现在表示协同作用的可加性线之下。**抄送：**通过DCFDA（通用RONS探针）染色检测RONS生成。上左边NAC预处理HT-29和SW480细胞，NO-ASA处理3h；通过SpectraMax测量DCFDA荧光强度。与对照细胞相比，处理样品中RONS的诱导作用表现为增加了倍。上*正确的*，用DPI预处理SW480细胞2小时，然后用NO-ASA处理3小时；流式细胞术检测DCFDA荧光强度。值为*意思是*±*扫描电镜。*

**图3。NO-ASA激活结肠癌细胞中RONS依赖信号**
答： *左上：*SW480细胞与20 mM NAC预孵育4 h或10μM DPI预孵育2 h，然后NO-ASA处理3 h。用EMSA测定核提取物中NF-κB的活性。*右上方*：NF-κB活性(*意思是*±*标准偏差*)在用磷酸阿司匹林或As处理的SW480细胞中₂哦_三，每个2xIC₅₀持续4小时；用NAC 20 mM预处理16小时。柱中的数字表示ODA450值。*左下方：*如图所示，HT-29细胞用磷酸-丙二醛或NO-ASA处理4 h，用NAC 20 mM预处理16 h。核蛋白接受EMSA。AP-2寡核苷酸被用作非特异性竞争物。B：MAPK磷酸化通过总细胞裂解物的免疫印迹测定。用NAC预处理细胞(左边)或DPI(*正确的*). 负载控制：β-肌动蛋白。C类：用NO-ASA处理HT-29细胞1h。用或不用DTT 1mM处理细胞蛋白裂解物30min，然后用抗Trx-1抗体进行免疫沉淀（IP），并对沉淀进行ASK1免疫印迹（IB）。

**图4。NO-ASA氧化Trx-1，Trx-1介导氧化应激诱导的细胞死亡**
答：用Western blot检测经NO-ASA处理1 h的SW480细胞全细胞裂解液中Trx-1的水平，如图所示。B：在与A中相同的处理后，按照材料和方法中的方法处理细胞裂解物，以识别Trx-1氧化还原形式，指示为红色=还原形式和ox=氧化形式；最上面的ox带是氧化程度最高的。HT-29细胞的细胞裂解物产生了类似的结果。**抄送：**用Trx-1 siRNA或非特异性siRNA转染SW480细胞72 h，用Western blotting分析细胞总裂解物(*上部小面板*). 在用siRNA转染后，用NO-ASA处理SW480细胞(*左下面板*)，磷酸舒林酸、三氧化二砷或磷酸阿司匹林，如所示，并通过膜联蛋白V染色评估细胞死亡。所有药物都增加了膜联蛋白V（+）细胞，在缺乏Trx-1的情况下，这种反应受到严重抑制。值为*意思是*±*扫描电镜。*

**图5。抗癌药物降低TrxR活性，TrxR抑制剂加剧细胞死亡**
A类：如图所示，用NO-ASA处理SW480和HT-29细胞1小时，收获细胞，并按照方法测量其TrxR活性(左边). 将HT-29细胞与其他三种抗癌药物一起处理1小时，每种药物单独用于其各自的IC₅₀.B：用不同浓度的NO-ASA处理SW480细胞1h，测定TrxR的表达(*左侧面板*)或带1xIC₅₀最长6小时(*右侧面板*).抄送：SW480细胞经不同浓度的NO-ASA处理16小时，然后进行24小时的预处理，包括或不包括TrxR抑制剂金硫氰酸盐（ATM）。显示了膜联蛋白V（+）细胞的百分比。ATM显著增强了NO-ASA诱导的细胞死亡。关于*正确的*根据annexin V染色的细胞死亡结果，评估NO-ASA和ATM之间的潜在协同作用。加法线连接IC₅₀单独使用时每种化合物的价值。A和B代表每种化合物的两个不同剂量对（每种化合物各自的浓度显示在每个点旁边）。值为*意思是*±*扫描电镜*.

**图6。Trx-1的氧化还原状态调节细胞存活：依赖细胞内RONS水平**
该图描述了Trx-1、TrxR和RONS之间的关系。随着RONS水平的增加，Trx-1从其完全减少的形式（Trx-1_红色)部分氧化（Trx-1_氧气-I)完全氧化的形式（Trx-1_氧-Ⅱ). 逆转Trx-1氧化的TrxR也被我们研究的化合物抑制。在低RONS浓度下，当Trx-1处于还原状态时，细胞死亡最小。随着RONS浓度的增加，细胞死亡很明显，在最高RONS浓度下变得巨大。中等RONS水平下的凋亡优势被较高RONS水平的坏死所取代。

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