Structural determinants of MIF functions in CXCR2-mediated inflammatory and atherogenic leukocyte recruitment

doi:10.1073/pnas.0804017105

.2008年10月21日；105(42):16278-83.

doi:10.1073/pnas.0804017105。 Epub 2008年10月13日。

CXCR2介导的炎症和致动脉粥样硬化白细胞募集中MIF功能的结构决定因素

克里斯蒂安·韦伯¹, 桑德拉·克莱默, 麦克·德雷克斯勒, 红旗路, 罗里·科恩, 阿芙罗狄特·卡普尼奥图, 阿尔玛·泽内克, 尤尔根·伯恩哈根

附属公司

PMID： 18852457
PMCID公司： PMC2566990型
内政部： 10.1073/pnas.0804017105

CXCR2介导的炎症和致动脉粥样硬化白细胞募集中MIF功能的结构决定因素

克里斯蒂安·韦伯等。美国国家科学院程序. 2008.

.2008年10月21日；105(42):16278-83.

doi:10.1073/pnas.0804017105。 Epub 2008年10月13日。

作者

克里斯蒂安·韦伯¹, 桑德拉·克莱默, 麦克·德雷克斯勒, 红旗路, 罗里·科恩, 阿芙罗狄特·卡普尼奥图, 阿尔玛·泽内克, 尤尔根·伯恩哈根

附属

¹德国亚琛亚琛分子心血管研究所（IMCAR）。cweber@ukaachen.de

PMID： 18852457
PMCID公司： PMC2566990型
内政部： 10.1073/pnas.0804017105

摘要

我们最近发现古老的细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）是CXC趋化因子受体CXCR2和CXCR4在炎症和动脉粥样硬化细胞募集中的非标准配体。由于其与CXCR2的亲和力特别高，我们假设MIF可能具有典型CXCR2配体共享的结构动机，即保守的N末端Glu-Leu-Arg（ELR）基序。序列比对和结构建模确实揭示了伪（E）LR基序（Asp-44-X-Arg-11），该基序由相邻环中的非相邻残基组成，但平行间距与真实ELR基序相同。结构-功能分析表明，残基R11、D44或两者的突变保留了MIF的适当折叠和内在催化特性，但严重损害了其与CXCR2的结合，并消除了MIF/CXCR2介导的在流动条件下单核细胞趋化和阻滞在内皮上的功能。R11A-MIF和R11A/D44A-MIF双突变体在体外灌注的颈动脉中以及在腹膜炎模型中应用后，在触发白细胞向早期动脉粥样硬化内皮细胞募集方面表现出明显缺陷。由于补偿性使用CXCR4，D44A-MIF在腹膜白细胞募集中的功能得以保留。结合起来，我们的数据确定了一个伪（E）LR基序作为MIF活性的结构决定因素，作为非标准CXCR2配体，它概括了趋化因子样配体与趋化因子的结构相似性，并能够选择性靶向促炎症MIF/CXCR2相互作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突声明：J.B.、C.W.和A.Z.是动脉粥样硬化抗MIF策略专利申请的发明人。J.B.是抗MIF抗体在炎症疾病中应用专利的发明者。J.B.和C.W.是一家正在制定反MIF战略的生物技术公司的股东。

数字

**图1。**
CXCL8和MIF的结构同源性及其ELR和*伪-（E）LR*动机。CXCL8二聚体的3D结构(A类)和MIF单体(B类)共享架构同源性。(A类)每个CXCL8单体的三个N-末端氨基酸Glu-3（E3）、Leu-4（L4）和Arg-5（R5）形成ELR基序，已知该基序对通过CXCR2的信号传导至关重要。(B类)构象的*伪-（E）LR*MIF的基序由两个非相邻残基Arg-11（R11）和Asp-44（D44）形成，它们在暴露的相邻环中以类ELR间距存在。注意，MIF的N-末端蛋氨酸被处理；因此，残留物的编号从Pro-1开始。(C类)指示ELR和*伪-（E）LR*CXCL8和MIF中的残留物。(D类)MIF三聚体结构的表面模型。遵循中方案的颜色代码C类，R11在每个亚单位中的位置用红色表示；D44以绿色突出显示。

**图2。**
描述*伪-（E）LR*MIF突变体。这个*伪（E）LR*突变体的制备过程与WT-MIF的制备程序几乎相同。(A类)净化*伪-（E）LR*突变体。R11A-MIF纯化的代表性银染SDS凝胶。通过高速旋转离心制备细胞裂解物(*L（左）*和*P（P）*). 集中后(C类，FT），通过阴离子交换色谱（MQ）和C8反相色谱纯化突变体（用20%乙腈[W]洗涤，用60%乙腈[E1，E2]洗脱）。分子量（M_第页)显示在左侧. (B类)整体结构完整性*伪-（E）LR*CD光谱证明的突变。将复性突变体与WT-MIF进行比较。每个残基的平均残基椭圆率（θ）是相对于波长绘制的。光谱是三种独立记录的代表。(C类)*伪-（E）LR*突变体表现出与野生型MIF相同的互变异构酶活性。通过测量475 nm处吸光度在4分钟内的下降来监测互变酶活性。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。(D类)突变体的独特构象稳定性。GdnHCl诱导的WT MIF和*伪-（E）LR*突变体，随后进行CD光谱分析。展开曲线表示为相对于天然蛋白质的展开百分比，该百分比是根据222nm处的椭圆度随GdnHCl浓度的变化计算得出的。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。

**图3。**
消减的CXCR2结合活性*伪-（E）LR*突变体。用放射性碘[I孵育体外表达表面CXCR2的HEK293细胞¹²⁵]CXCL8示踪剂与WT MIF或*伪-（E）LR*如图所示，突变体作为竞争对手。图表示特定[I的百分比¹²⁵]CXCL8在指定的竞争对手浓度下结合。(A类)受体竞争测定在竞争对手浓度范围内的曲线图。(B类)竞争对手浓度为1×10时的竞争对手效应比较⁻⁶M MIF或*伪-（E）LR*突变体和1×10⁻⁷M CXCL8。数据表示7到10个独立实验的平均值±SEM。星号表示*伪-（E）LR*突变体与WT MIF在指定浓度（*，*P（P）*< 0.01; **,*P（P）*< 0.005; ***,*P（P）*< 0.0005).

**图4。**
这个*伪-（E）LR*基序对MIF的单核细胞募集活性至关重要体外. (A类)对CXCR2介导的单核细胞阻滞的影响。HAoEC与WT MIF预孵育，*伪-（E）LR*用钙黄绿素AM染色的MonoMac6细胞灌注突变株或HAoEC单层前的缓冲液。通过计数多个高功率场来量化粘附细胞；数据（7到9个独立实验的平均值±SEM）表示为粘附单核细胞相对于对照的相对增加。(B类)对CXCR2介导的单核细胞趋化性的影响。将THP-1单核细胞添加到Transwell室的上部隔室，并允许其迁移以响应WT MIF或*伪-（E）LR*下室中的突变体。该图表示蛋白质浓度为100 ng/ml时的趋化指数。数据表示5到6个独立实验的平均值±SEM。

**图5。**
这个*伪-（E）LR*motif对MIF介导的动脉粥样硬化颈动脉单核细胞阻滞至关重要。的影响*伪-（E）LR*颈动脉MonoMac6单核细胞阻滞突变体*mif公司*⁻^/−*低密度脂蛋白受体*^−/−小鼠喂食西方饮食6周，并与WT-MIF进行比较。在灌注钙黄绿素标记的单核细胞10分钟后，计算每个颈动脉的粘附细胞数。用*伪-（E）LR*与WT-MIF治疗相比，所示突变体或缓冲液（对照）正常化。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。

**图6。**
的角色*伪-（E）LR*急性心肌梗死患者MIF触发中性粒细胞募集的基序体内小鼠腹膜炎模型。C57BL/6小鼠(n个=每组3个），静脉注射200 ng WT MIF或*伪-（E）LR*如图所示的突变体，或单独或与CXCR4拮抗剂AMD3465一起，如图所述。腹腔中性粒细胞浸润，以CD45的百分比表示⁺细胞，通过FACS分析确定。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。

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