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.2008年12月；57(12):3222-30.
doi:10.2337/db08-0610。 Epub 2008年10月3日。

内皮细胞AMP活化蛋白激酶上调线粒体解偶联蛋白-2减轻糖尿病氧化应激

谢忠林 1, 张俊华, 吴季良, 贝诺伊特·维奥利特, 邹明辉
附属公司

AMP活化蛋白激酶上调内皮细胞线粒体解偶联蛋白-2减轻糖尿病氧化应激

谢忠林等。 糖尿病. 2008年12月.

摘要

目标：最近的证据表明，AMP-活化蛋白激酶（AMPK）是糖尿病的重要治疗靶点。本研究旨在确定AMPK激活如何抑制糖尿病患者前列环素合成酶的酪氨酸硝化。

研究设计和方法：用5-氨基-4-咪唑酰胺核苷（AICAR）处理融合的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）或小鼠，检测AMPK磷酸化和线粒体解偶联蛋白（UCP）-2的表达。

结果：HUVEC暴露于高糖（30 mmol/l）会增加超氧阴离子（O（2））。（-）和前列环素合酶硝化。此外，组分活性AMPK（Ad-CA-AMPK）的过度表达或AICAR的加入都降低了O（2）。（-）和前列环素合成酶硝化作用由高糖引起，而腺病毒过度表达显性负性AMPK突变体（Ad-DN-AMPK）增强了高糖的后一种效应。HUVEC暴露于AICAR或二甲双胍均可导致UCP-2 mRNA和UCP-2蛋白的AMPK依赖性上调。此外，UCP-2的过度表达显著消融了O（2）。高糖引发的前列环素合酶硝化作用。此外，Ad-CA-AMPK的过度表达增加，而Ad-DN-AMPK过度表达抑制AICAR诱导的Thr180/Tyr182处p38激酶的磷酸化。SB239063对p38激酶的抑制对AICAR诱导的AMPK-Thr172磷酸化没有影响，并呈剂量依赖性抑制AICAR导致的UCP-2上调，表明AMPK位于p38激酶上游。最后，AICAR显著增加UCP-2的表达并降低O（2）。糖尿病野生型小鼠中的（-）和前列环素合成酶硝化作用，但在体内的AMPKalpha2缺乏对应物中没有。

结论：我们得出的结论是，AMPK的激活增加了UCP-2，从而抑制了两种O（2）。（-）和前列环素合酶硝化在糖尿病中的作用。

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数字

图1。
图1。
用0.5 mmol/l AICAR激活AMPK可减少HUVEC中高糖诱导的氧化应激和前列环素合酶硝化。汇合的HUVEC暴露于5 mmol/ld日-葡萄糖（NG），30 mmol/ld日-葡萄糖（HG），或5 mmol/ld日-葡萄糖加25 mmol/l甘露醇（OG）72小时，加或不加0.5 mmol/lAICAR。孵育后，O2·负极(A类)，环GMP（NO生物活性）(B)，8-iso-PGF2α(▪, −AICAR；□+AICAR）(C)和前列环素合成酶活性（由PGH的转化反映2至6-酮-PGF1α) (D类)进行了化验(n个= 12, #P（P）<0.01高糖与正常葡萄糖，♣P（P）<0.01高糖vs.高糖加AICAR。免疫沉淀；前列环素合酶；WB、Western blot）。
图2。
图2。
长期服用AICAR可减弱HUVEC中高糖增强的前列环素合酶硝化作用。将汇合的HUVEC暴露于0.5 mmol/l AICAR达指定时间。前列腺环素合成酶、硝化前列腺环素合酶和前列腺环素酶活性的测定如研究设计与方法.A类AICAR对人脐静脉内皮细胞前列环素合酶蛋白表达的影响；n个= 7.B：0.5 mmol/l AICAR对HUVEC中前列环素合酶活性的影响；n个= 7. □, 控制；▪, AICAR公司。C和D类：AICAR给药可减弱HUVECs中高糖增强的前列环素合酶硝化作用；n个= 5, #P（P）<0.01高糖与正常葡萄糖，♣P（P）<0.01高糖vs.高糖加AICAR。免疫沉淀；前列环素合酶；WB、Western blot。
图3。
图3。
AICAR诱导的UCP-2在HUVECS中的表达是AMPK依赖性的。A类：通过AICAR或二甲双胍激活AMPK。该印迹是来自四个单独实验的四个印迹的代表性印迹。B：Ad-DN-AMPK对O的影响2·负极高糖诱导的生产(n个= 3, #P（P）<0.05正常葡萄糖对高葡萄糖或高葡萄糖/Ad-GFP，♣P（P）<0.05 Ad-GFP/高糖/AICAR vs.GFP/高糖或高糖P（P）<0.05 Ad-DN-AMPK与正常葡萄糖，†P（P）<0.05 AD-DN-AMPK/AICAR/高葡萄糖vs.AD-GFP/高葡萄糖/AICAR）。C：AICAR增加HUVEC中UCP-2 mRNA(n个= 3, ♣P（P）<0.05对照组与二甲双胍或AICAR）。D类：AICAR增强的UCP-2表达依赖于AMPK(n个= 3, *P（P）<0.05 vs.GFP vs.GFP+AICAR，†P（P）<0.05 AICAR+GFP vs.AICAR+AD-DN-AMPK）。
图4。
图4。
UCP-2过度表达抑制高糖诱导的ROS生成。A类：过度表达UCP-2增加HUVEC中的UCP-2蛋白。该斑点是来自三个单独实验的三个斑点的代表。B：过度表达UCP-2抑制高糖诱导的O2·负极生产(n个= 3, #P（P）<0.05 GFP加高糖vs.GFP加正常葡萄糖，♣P（P）<0.05 GFP/高糖vs.UCP-2/高糖）。C：过度表达UCP-2抑制高糖增强的3-硝基酪氨酸(n个= 5, #P（P）与GFP加正常葡萄糖相比，<0.05 GFP加高葡萄糖，♣P（P）<0.05 GFP加高糖vs.UCP-2加高糖）。D类：过度表达UCP-2减弱HUVEC中高糖诱导的前列环素合酶硝化作用(n个= 5, #P（P）<0.05高糖与正常葡萄糖，GFP/高糖与GFP/正常葡萄糖；♣P（P）<0.05 GFP/高糖vs.高糖或OG；†P（P）<0.05高糖/GFP vs.高糖/UCP-2）。E类：UCP-2过度表达对高糖诱导的前列环素合酶失活的影响(n个= 5, #P（P）<0.05正常血糖vs.高糖或高糖/GFP，♣P（P）<0.05 GFP/高糖vs.高糖/UCP-2）。
图5：。
图5：。
p38激酶是AMPK依赖性UCP-2表达所必需的。A类：AICAR对HUVEC中c-Jun和p38激酶磷酸化的影响。在指定时间用0.5 mmol/l AICAR处理汇合的HUVEC。印迹是来自三个独立实验的三个印迹的代表。B：AICAR增加的c-Jun和p38磷酸化依赖于AMPK。HUVEC感染了Ad-AMPK-CA或Ad-AMPK-DN。该斑点是来自三个独立实验的三个斑点的代表。C：SB239063对AICAR增强HUVEC中p38磷酸化的影响。在存在或不存在不同浓度的选择性p38抑制剂SB239063的情况下，用0.5 mmol/l的AICAR处理HUVEC(n个= 4, #P（P）<0.05 AICAR与对照，♣P（P）<0.05 AICAR与AICAR加SB239063）。D类：SB239063对AICAR上调UCP-2表达的影响(n个= 4, #P（P）<0.05 AICAR与对照，♣P（P）<0.05 AICAR与AICAR加SB239063）。E类：SB239063对AICAR引起的HUVEC中AMPK-Thr172磷酸化的影响(n个= 4, #P（P）<0.05 AICAR与对照，♣P（P）<0.05 AICAR与AICAR加SB239063）。
图6。
图6。
AMPK减少与STZ诱导的糖尿病相关的氧化应激、前列环素合酶硝化和UCP-2表达。A类：AICAR对主动脉O的影响2·负极患有和不患有糖尿病的野生型和AMPKα2 KO小鼠的水平(n个= 6–8, #P（P）<0.05 STZ与对照组；♣P（P）<0.05 STZ+AICAR vs.STZ，†P（P）AMPKα2 KO中<0.05 STZ加AICAR与野生型STZ加AICAR；P（P）<0.05，AMPK KO对照与野生型对照）。B：AICAR对患有和不患有糖尿病的野生型和AMPKα2 KO小鼠主动脉前列环素合酶活性的影响(n个= 6–8, #P（P）<0.05 STZ与对照，♣P（P）<0.05 STZ+AICAR vs.STZ，P（P）<0.05，野生型STZ加AICAR，而AMPKα2 KO中STZ加ALCAR）。C：使用和不使用AICAR治疗的糖尿病小鼠的主动脉前列环素合酶硝化(n个= 6–8, #P（P）<0.05 STZ与对照，♣P（P）<0.05 STZ加AICAR与野生型STZ相比，†P（P）AMPKα2 KO中<0.05 STZ加AICAR与AMPKP（P）<0.05野生型对照与AMPKα2 KO对照）。D类：AICAR治疗的糖尿病野生型和AMPKα2 KO小鼠中UCP-2水平的免疫组织化学染色(顶部); AICAR体内AMPK依赖性UCP-2的表达(底部) (n个= 6–8, #P（P）<0.05 STZ与对照，♣P（P）<0.05 STZ+AICAR vs.野生型STZ†P（P）AMPKα2 KO中<0.05 STZ加AICAR，而AMPK（2 KO）中为STZ。（请参见http://dx.doi.org/10.2337/db08-0610以获得此图形的高质量数字表示。）
图7。
图7。
过氧化氢酶对高糖增强HUVEC中UCP-2表达的影响。将汇合的HUVEC暴露于有或无500单位/ml过氧化氢酶的高糖或正常葡萄糖中2小时。使用特异性抗体在Western blot中检测AMPK-Thr172和UCP-2的水平(n个= 3–5, ♣P（P）<0.05正常葡萄糖vs.高糖或高糖加过氧化氢酶，†P（P）<0.05高糖vs.高糖加过氧化氢酶）。□, P-AMPK公司。▪, UCP2。
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