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.2009年2月；50(2):204-13.
doi:10.1194/jlr。M700505-JLR200。 Epub 2008年9月23日。

富含甘油三酯的脂蛋白脂解释放中性和氧化FFA，诱导内皮细胞炎症

王利民（Limin Wang） 1, 拉詹·吉尔, 特蕾莎·佩德森, 劳拉·希金斯, 约翰·W·纽曼, 约翰·拉特利奇
附属公司

富含甘油三酯的脂蛋白脂解释放中性和氧化FFA，诱导内皮细胞炎症

王利民（Limin Wang）等。 脂质研究杂志. 2009年2月.

摘要

富含甘油三酯的脂蛋白（TGRL）脂解产物提供一种能改变内皮屏障功能的促炎症刺激。为了探讨这种脂解诱导事件的机制，我们通过脂蛋白脂肪酶（LpL）评估了人餐后TGRL衍生的脂质类的促炎症潜能。TGRL与LpL孵育30分钟后，孵育液的饱和和不饱和FFA含量显著增加。此外，通过LpL脂解，羟基亚油酸9-羟基癸二烯酸（9-HODE）和13-HODE的浓度升高，高于其他测得的氧化脂质。FFA组分诱导人主动脉内皮细胞（HAEC）中TNFalpha、细胞内粘附分子表达和活性氧（ROS）生成的促炎症反应。细胞色素P450 2C9抑制剂磺胺酚唑和NADPH氧化酶抑制剂均阻断了FFA介导的活性氧增加。与亚油酸盐相比，13-HODE被发现是HAEC中ROS生成的更有效诱导剂，该活性对NADPH氧化酶和细胞色素P450抑制剂都不敏感。因此，虽然FFA在内皮细胞中的氧化代谢可以产生炎症反应，但TGRL脂解也可以释放预先形成的氧化应激介质（例如HODEs），这些介质可能通过刺激细胞内ROS的产生而影响体内内皮细胞的功能。

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图1。
图1。
含或不含脂蛋白脂肪酶（LpL）培养的高甘油三酯脂蛋白（TGRL）中的PUFA。使用含或不含LpL的人餐后VLDL（A）、乳糜微粒（CM）（B）或TGRL（C）[2.5 mg甘油三酯（TG），用于脂质提取和氧化脂质测量。对于LpL依赖性脂解，将LpL与CM、VLDL或TGRL在37°C下预孵育30分钟，并在样品提取和FA分析之前通过在冰上转移试管来停止反应。随着LpL处理的进行，VLDL、CM和TGRL中的亚油酸（LA）和花生四烯酸（AA）以及n-3 FAsα-亚油酸、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）的浓度增加。一脂质被伪量化，并通过相对响应因子进行调整，以估计其浓度，并允许对这些数据进行一致的图形表示。数据为平均值±SEM（n=3）。
图2。
图2。
含或不含LpL培养的VLDL中的氧化脂质。LpL处理增加了氧化脂质的浓度。使用含或不含LpL的人餐后VLDLs（2.5 mg TG）进行脂质提取和氧化脂质测量。对于LpL依赖的VLDL脂解，在37°C下将LpL与VLDL预培养30分钟，并在样品提取之前将试管转移到冰上，从而停止反应。LA氧化产物（A）环氧十八碳烯酸（epoxy octadeconoic acid，EpOME）、二羟基十八碳二元酸（DHOME）、羟基十八碳二烯酸（HODE）和氧代十八碳二酸（oxo-ODE），以及AA氧化产物（B）环氧二十碳三烯酸（EET）、二氢二十碳三羧酸（DHET）、羟基二十碳四烯酸（HETE），并测定了氧代二十碳四烯酸（oxo-ETE）。数据为平均值±扫描电镜（n=3）。
图3。
图3。
VLDL及其LpL脂解衍生物增加内皮细胞TNFα生成（A）和细胞内粘附分子（ICAM）表达（B）。ELISA法检测人主动脉内皮细胞TNFα水平和ICAM表达。用从VLDL（50 mg/dl TG）中分离的单个脂质处理12孔板中的内皮细胞培养物2 h，用LpL（2 U/ml）孵育或不孵育30 min。从VLDL中分离出每一组分，蒸发，再溶解，并输送至PBS载体（5μl）中的细胞。测量用TNFα（10 ng/ml，16 h）刺激的TNFα水平或ICAM表达。脂肪分解释放的过量FFA增加了HAEC上TNFα的表达和TNF诱导的ICAM的表达。数据为平均值±SEM（n=6）。CTRL，控制；游离脂肪酸；PL，磷脂；CE，胆固醇酯；甘油三酯；FC，游离胆固醇；DG，甘油三酯；MG，单酰基甘油。
图4。
图4。
从VLDL中分离的脂质组分对HAEC中活性氧（ROS）生成的影响。从VLDL（50 mg/dl TG）中分离出每个脂质部分，蒸发、再溶解，并将其输送至PBS载体（5μl）中的细胞。HAEC用H预先培养30分钟2O（运行）2-敏感荧光探针DCF-AM（10μM），然后用从VLDL中分离的单个脂质培养2小时，用LpL（2 U/ml）培养30分钟。用荧光微孔板阅读器测量细胞的荧光强度。DCF-AM氧化的荧光分布以荧光单位（FU）表示，并以平均值±SEM表示（n=6）*对< 0.01. CTRL，控制；游离脂肪酸；PL，磷脂；CE，胆固醇酯；甘油三酯；FC，游离胆固醇；DG，甘油三酯；MG，单酰基甘油。
图5。
图5。
在没有或存在酶抑制剂的情况下，从VLDL（V-FFA）和VLDL脂解（V+L-FFA）中分离的FFA对HAEC中ROS生成的影响。从VLDL（50 mg/dl TG）中分离出每个脂质部分，蒸发、再溶解，并将其输送至PBS载体（5μl）中的细胞。HAEC与荧光探针DCF-AM（10μM）预孵育30分钟，然后与从极低密度脂蛋白中分离的FFA孵育2小时，在不存在或存在别嘌醇（FFA-AP）（100μM）、罗布麻素（FFA-AC）（100μM）、磺胺酚唑（FFA-SP）（10μM）或DPI（FFA-DPI）（50μM）的情况下，与LpL（2 U/ml）孵育30分钟。用荧光微孔板阅读器测量细胞的荧光强度。DCF-AM氧化的荧光分布以荧光单位（FU）表示，并以平均值±SEM表示（n=6）。平均值的显著差异由双尾学生的t吨-测试(*对与V-FFA相比<0.05**对<0.05 vs.V+L-FFA）。
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