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.2008年9月17日；28(38):9451-62.
doi:10.1523/JNEUROSCI.2674-08.2008。

系统性炎症改变小鼠实验性卒中后脑血管紧密连接中断的动力学

巴里·麦克尔 1, 南希·罗斯韦尔, 斯图亚特·艾伦
附属公司

系统性炎症改变小鼠实验性卒中后脑血管紧密连接中断的动力学

巴里·麦克尔等。 神经科学. .

摘要

感染等全身炎症事件增加了中风的风险，并与更糟糕的结果相关，但这种临床重要影响的介质尚不清楚。我们的目的是阐明全身炎症对小鼠轻度缺血性脑损伤的有害影响的机制。通过外周血白细胞介素-1β（IL-1β）激发和短暂大脑中动脉闭塞（MCAo）局部脑缺血诱导小鼠全身炎症。系统性炎症通过将紧密连接蛋白claudin-5的短暂破坏转化为持续破坏，导致血脑屏障（BBB）破坏动力学发生改变，同时也显著加剧了脑血管基底膜蛋白胶原蛋白IV的破坏。这些变化与全身炎症诱导的神经血管凝胶溶解活性的增加有关，这种增加是由MCAo后IL-1β激发小鼠大脑中中性粒细胞衍生的基质金属蛋白酶-9（MMP-9）增加五倍介导的。MMP-9的特异性抑制消除了全身炎症对claudin-5持续而非急性破坏的影响，claudin5与脑血管肌球蛋白轻链磷酸化有关。MMP-9的抑制也减轻了全身炎症对脑损伤、水肿、神经功能缺损和出血性转化发生率的有害影响。这些数据表明，由中性粒细胞衍生的神经血管MMP-9活性增强引起的暂时性到持续性BBB破坏的转变是全身炎症导致缺血性脑损伤加重的关键机制。这些机制可能会导致既往感染的卒中患者临床结局不佳。

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数字

图1。
图1。
全身炎症导致MCAo后持续的claudin-5破坏。通过腹腔注射IL-1β诱导全身炎症，并在MCAo后的指定时间通过免疫印迹和免疫荧光检测MCAo对同侧皮质组织中BBB紧密连接蛋白claudin-5和clodin的影响。A类,再灌注4小时后，与假手术小鼠相比，MCAo诱导溶媒（veh）和IL-1β处理小鼠的claudin-5水平降低50%。在MCAo后8小时，车用小鼠体内的claudin-5破坏消失，并在24小时内保持不变，其中claudin5水平与假手术小鼠相似。MCAo后8小时和24小时，IL-1β处理小鼠的claudin-5持续受到破坏，导致24小时时与假手术小鼠相比减少70%。IL-1β激发小鼠的claddin-5持续丢失导致MCAo 8小时和24h后与车辆处理小鼠相比显著减少。B类，Claudin-5免疫荧光（绿色通道）和DAPI复染（蓝色通道）显示了错误操作小鼠脑血管免疫反应的密集网络。与免疫印迹数据一致，经车辆处理的小鼠在MCAO后4 h，IL-1β激发的小鼠在MC后4、8和24 h，免疫反应明显降低。C类共聚焦免疫荧光显示，MCAo后24小时，系统性炎症破坏了同侧大脑半球皮质血管内皮间紧密连接处claudin-5的高度有序排列。D类，全身炎症或MCAo对闭塞素水平没有显著影响。所有免疫荧光图像均来自同侧皮质至MCAo*第页与车辆相比<0.05；学生的t吨测试。比例尺：B类，100微米；C类，10微米。
图2。
图2。
全身炎症加重MCAo后脑血管胶原蛋白IV的破坏。通过腹腔注射IL-1β诱导全身炎症，并在MCAo后的指定时间通过免疫印迹和免疫荧光法评估MCAo同侧皮质组织对脑血管基底膜蛋白、胶原蛋白IV和层粘连蛋白的影响。A类在研究的所有时间点，经溶媒（veh）治疗的小鼠在假手术和MCAo后的胶原蛋白-IV水平相似。随着再灌注的进展，IL-1β激发导致IV型胶原蛋白逐渐下降，与MCAo后24小时的假手术水平相比，IL-1？激发导致IV级胶原蛋白水平下降80%。MCAo后8小时和24小时，IL-1β激发的小鼠与车辆处理的小鼠相比，其胶原蛋白IV水平显著降低，并且在这些时间点，推测的胶原蛋白IV裂解产物（圆圈）在IL-1β刺激的小鼠中明显存在。B类，IV型胶原免疫荧光（绿色通道）和DAPI复染（蓝色通道）在假手术小鼠中显示出广泛而密集的脑血管免疫反应网络，并且在MCAo后的载体处理小鼠中也表现出类似的模式。MCAo后4、8和24小时，IL-1β激发诱导胶原蛋白IV免疫反应显著降低。C类系统性炎症或MCAo对层粘连蛋白水平没有显著影响。所有免疫荧光图像均来自同侧皮质至MCAo*第页与车辆相比<0.05；学生的t吨测试。比例尺，50μm。
图3。
图3。
全身炎症加剧神经血管胶溶活性。A类,B类，腹腔注射IL-1β诱导全身炎症，并通过凝胶酶谱法测定纯化的大脑皮层样品的凝胶溶解活性(A类)和依据就地MCAo后指定时间脑切片的酶谱(B类).A类MCAo后4 h，明胶溶解活性最低，且溶媒（veh）和IL-1β处理的小鼠之间没有差异。在溶媒和IL-1β处理的小鼠MCAo后8和24小时，与前MMP-9（105 kDa）和活性MMP-9相对应的明胶溶条带清晰可见，但假闭塞后不明显。MCAo后8小时和24小时，IL-1β处理小鼠的凝胶溶解活性（105 kDa）显著增加。没有与MMP-2（72 kDa）相对应的可检测凝胶溶解活性。B类,现场酶谱图显示，IL-1β激发小鼠凝胶溶解活性的增加主要局限于MCAo后8和24小时的脑血管和神经元。现场假手术小鼠的凝胶溶解活性最低，并通过与MMP-9抑制剂SB-3CT共同培养而减弱。C类，免疫荧光结合就地酶谱分析以确定胶溶活性的定位。D类明胶溶解活性与血管基底膜蛋白、层粘连蛋白和神经元标记物neuN共定位**第页与车辆相比<0.01；学生的t吨测试。比例尺：B类，100微米；C类，15微米；D类，25微米。
图4。
图4。
MCAo后全身炎症增加脑MMP-9免疫反应。通过腹腔注射IL-1β诱导全身炎症，并在MCAo后指定时间进行MMP-9免疫染色。A–C，MMP-9免疫染色在粘附于皮质穿透血管的细胞中明显(A类)和微血管(B类)在整个薄壁组织的细胞中(C类)位于MCAo的同侧半球。对侧半球和假手术小鼠的免疫反应极小。D类，典型的脑切片显示，MCAo后8和24小时，IL-1β处理小鼠皮层中MMP-9免疫活性细胞显著增加。E类，细胞MMP-9免疫反应的定量。系统性炎症显著增加了MCAo后4、8和24小时皮质和8小时纹状体中MMP-9+细胞的数量*第页< 0.05, **第页与车辆（veh）相比<0.01；学生的t吨测试。比例尺：（英寸C类)A–C，25微米；D类，100微米。
图5。
图5。
浸润的中性粒细胞是缺血脑中MMP-9的主要来源。用双标记免疫荧光法检测MMP-9免疫反应在缺血脑内的细胞定位。A类MMP-9与特定中性粒细胞标记物SJC之间存在强烈且广泛的共定位，但与神经元（neuN）、星形胶质细胞（GFAP）或小胶质细胞（Iba1）标记物之间没有共定位。MMP-9与血管基底膜蛋白层粘连蛋白也有很强的共定位。B类，使用抗PMN抗体消耗中性粒细胞消除了大脑中的细胞和血管MMP-9免疫反应性，但使用同种型对照抗体没有影响。C类，MMP的数量与+载体和IL-1β处理小鼠皮层中的细胞和中性粒细胞数量。R（右）2= 0.91;第页<0.01，皮尔逊相关。所有双标记免疫荧光图像均为IL-1β处理小鼠MCAo后24小时同侧皮质至MCAo的图像。比例尺：A类，25微米；B类，100微米。
图6。
图6。
全身炎症引起的缺血后血脑屏障破坏的持续加重依赖于MMP-9。A类,B类腹腔注射IL-1β诱导全身炎症，使用特异性抑制剂SB-3CT抑制MMP-9对BBB紧密连接蛋白claudin-5的影响(A类)和脑血管基底膜蛋白，胶原蛋白IV(B类)在MCAo后的指定时间，用免疫印迹法在同侧皮质组织中评估。A类，MCAo在溶媒（veh）和IL-1β处理的小鼠再灌注4 h后诱导claudin-5水平降低75%，此时MMP-9的抑制作用不起作用。MCAo后8小时和24小时，Claudin-5水平恢复到假闭塞水平，MMP-9抑制作用不明显。MCAo后8和24小时，外周炎症激发导致claudin-5持续减少，MMP-9的抑制显著减弱了这些影响。B类假闭塞和MCAo后，车辆处理小鼠在所有检查时间点的胶原蛋白-IV水平相似。MCAo后8和24小时，外周炎症激发诱导胶原蛋白IV显著减少，MMP-9的抑制显著减弱了这些影响*第页与车辆相比<0.05，#第页与IL-1β、Kruskal–Wallis试验和Dunn的多重比较试验相比，<0.05。
图7。
图7。
抑制MMP-9可减轻全身炎症导致的缺血性脑损伤加重。通过腹腔注射IL-1β诱导全身炎症，并在MCAo后24 h测定使用特异性抑制剂SB-3CT抑制MMP-9对缺血性脑损伤程度、脑水肿和神经功能缺损程度的影响。A–C，全身炎症显著加剧了缺血性损伤的体积(A类)、脑水肿的程度(B类)以及神经系统缺陷(C类). MMP-9的抑制显著减轻了全身炎症对脑损伤的有害影响(A类)，水肿(B类)和神经功能缺损(C类).D类代表性甲酚紫染色脑切片显示，全身炎症加剧了脑损伤，SB-3CT减弱了这种影响。E类，SB-3CT阻止了全身炎症引起的出血性转化（箭头）。F类,G公司，MMP-9的抑制也减弱了中性粒细胞浸润的增强(F类)和胶溶活性(G公司)由外周炎症激发引起。A类,B类,F类: *第页<0.05与车辆（veh）相比，#第页与IL-1β相比<0.05，单因素方差分析后为Student’st吨Bonferroni校正试验；C类: *第页与车辆相比<0.05，#第页=0.05与IL-1β，广义Fisher精确检验，Bonferroni校正。比例尺，100μm。
图8。
图8。
MMP-9在BBB中断中的暂时参与是全身炎症导致缺血性脑损伤加重的基础。我们的数据表明，基于MMP-9的参与，血脑屏障破坏有两个阶段。第一阶段是MMP-9诱导的依赖性阶段，也独立于全身炎症发生，表明存在局部的CNS驱动机制，如细胞因子/ROS诱导的内皮肌球蛋白轻链磷酸化。当没有额外的外周炎症刺激时，BBB中断的这一阶段是可逆的。系统性炎症导致继发性MMP-9依赖性破坏阶段，该阶段由系统性驱动（可能由中性粒细胞驱动），并使最初的破坏复合，导致持续和不可逆的BBB功能障碍。全身炎症对缺血性脑损伤的有害影响突出了BBB作为CNS驱动和全身驱动炎症过程的汇聚点的重要地位。车辆、车辆。
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