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.2008年9月；38(9):2438-50.
doi:10.1002/eji.200838289。

葡萄糖剥夺抑制CD8+T细胞中多个关键基因表达事件和效应器功能

坎迪斯·查姆 1, 格雷戈里·德莱森斯, 詹姆斯·奥基夫, 托马斯·加耶夫斯基
附属公司

葡萄糖剥夺抑制CD8+T细胞中多个关键基因表达事件和效应器功能

坎迪斯·查姆等。 欧洲免疫学杂志. 2008年9月.

摘要

我们最近报道，CD8（+）T细胞从幼稚状态向效应状态的分化涉及葡萄糖依赖性代谢的上调。葡萄糖剥夺或2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）对糖酵解的抑制选择性地抑制IFN-γ的产生，但不抑制IL-2的产生。为了确定葡萄糖代谢对效应T细胞功能的更全面的作用，我们对存在或不存在2-DG刺激的CD8（+）效应T细胞进行了基因阵列分析。我们观察到，2-DG仅抑制TCR/CD28信号诱导的10%的基因表达。其中包括关键细胞因子、细胞周期分子和细胞毒性颗粒蛋白的基因。与这些结果一致，IFN-gamma和GM-CSF的产生、细胞周期进展、细胞周期蛋白D2蛋白的上调、细胞溶解活性、颗粒酶B蛋白的上调以及结合物的形成都具有极强的葡萄糖依赖性。与葡萄糖相比，CD8（+）效应T细胞很少利用氧气，相对缺氧不会抑制这些CTL功能特性。我们的结果表明，葡萄糖在调节CD8（+）T细胞的特定效应器功能方面发挥着特别关键的作用，并对维持靶组织微环境（如实体肿瘤）中细胞免疫反应的效应器阶段具有重要意义。

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利益冲突声明

利益冲突：作者声明没有财务或商业利益冲突。

数字

图1
图1。使用代表35000个寡核苷酸的Affymetrix芯片分析基因表达
2-DG仅影响受刺激CD8中的一部分基因+效应T细胞。CD8（CD8）+在存在或不存在50 mM 2-DG的情况下，用抗CD3和抗CD28单克隆抗体涂层珠刺激效应T细胞12小时。控制（Ctrl），非模拟；刺激（Stim）；在50 mM 2-DG（2-DG）存在下刺激。受2-DG治疗影响的基因包括IFN-γ（A）、几种细胞因子，包括GM-CSF、IL-3、IL-9、IL-10（B），但不包括MIP-1β和IL-2（C）。与未调控的控制基因如γ-微管蛋白和TCR-β（F）相比，细胞溶解和增殖基因如穿孔素、颗粒酶B（D）和细胞周期蛋白D2（E）也受到2-DG处理的高度影响。使用dChip软件对个体杂交进行标准化，然后取平均值。数据表示两个独立实验的平均值+SD。
图2
图2。效应细胞因子的产生、增殖和细胞溶解活性是葡萄糖依赖性的
A.CD8产生IFN-γ+用ELISA检测抗CD3和抗CD28刺激后的效应T细胞。刺激24小时后收集上清液。数据表示三个独立实验的平均值+SD，2-DG效应具有统计学意义（p<0.01）。B.用50 mM 2-DG处理12小时的细胞中IFN-γmRNA的定量RT-PCR。C.CD8的GM-CSF生产+用抗CD3和抗CD28单克隆抗体包被珠刺激后的效应T细胞用ELISA检测。刺激24小时后收集上清液。数据表示三个独立实验的平均值+SD，2-DG对所有浓度的抑制均具有统计学意义（p<0.001）。D.用50 mM 2-DG处理12小时的细胞中GM-CSF mRNA的定量RT-PCR。数据代表至少两个独立实验。E.CD8产生IFN-γ+用ELISA法检测OVA肽体内激发的T细胞。用OVA肽体外再刺激20小时后收集上清液。对于所有测试浓度，2-DG对IFN-γ的影响具有统计学意义（p<0.001）。F.CD8产生IFN-γ+用ELISA法检测OVA肽体内激发的T细胞。用抗CD3和抗CD28单克隆抗体涂层珠刺激20小时后收集上清液。对于所有测试浓度，2-DG对IFN-γ的影响具有统计学意义（p<0.001）。E和F的数据表示两个独立实验的平均+SD。
图3
图3。2-DG阻断CD8的细胞溶解活性+效应T细胞
A.通过定量RT-PCR评估50mM 2-DG对穿孔素和颗粒酶C mRNA水平诱导的影响。数据表示两次独立分析的平均值。B.CD8的细胞溶解活性+效应T细胞在4小时内测定51在存在或不存在50 mM 2-DG的情况下进行Cr释放试验。数据表示五个独立实验的平均值。2-DG对各E:T比值的抑制具有统计学意义（P<0.01）。C.在存在或不存在50mM 2-DG的情况下，评估2C和P815-B7.1靶点之间的共轭形成。将钙调素AM标记的T细胞（绿色）与PKH标记的P815-B7.1细胞（红色）结合指定的时间段。使用流式细胞术来确定缀合物在细胞总数中的百分比。数据表示三个合并实验的平均值+SD。D.在存在或不存在50mM 2-DG的情况下，通过微管蛋白染色（红色）测量T细胞/靶细胞缀合物中的MTOC重新定向。所示数据是分析的至少20个共轭物的代表性图像。E.T细胞/靶细胞结合物中cSMAC的形成。使用PKCθ（绿色）和talin（红色）抗体。靶细胞用CMAC（蓝色）染色。图像代表了至少20个分析的共轭物。
图4
图4。2-DG抑制刺激CD8的细胞周期进展+效应T细胞
A.在存在或不存在2-DG的情况下，定量RT-PCR检测经抗CD3和抗CD28单克隆抗体包衣的细胞中cyclin D2 mRNA水平。数据表示两个独立实验的平均值。B[三H] 在存在或不存在2-DG的情况下，用抗CD3/抗CD28单克隆抗体包被珠刺激的细胞中评估胸腺嘧啶掺入。数据表示三个独立实验的平均+SD，2-DG的抑制具有统计学意义（p<0.001）。C.CFSE标记的2C CD8+在存在或不存在10 mM 2-DG的情况下，用P815-B7.1细胞刺激效应T细胞。48小时后，用流式细胞仪分析CFSE的稀释度。D.用或不用10mM 2-DG刺激48小时的效应T细胞的DNA含量进行评估。
图5
图5。选定蛋白质的Western blot分析
2C/RAG2型-/-效应器CD8+在存在或不存在2-DG的情况下，用抗CD3/抗CD28单克隆抗体涂层珠刺激T细胞16小时。收集细胞，裂解，用SDS-PAGE分离，并用印迹法检测所示蛋白。箭头指示背景带上方的Granzyme B带。在两个独立的实验中也看到了类似的结果。
图6
图6。选择性效应器功能受缺氧影响最小
A.和B.通过ELISA评估缺氧条件下IL-2（A）或IFN-γ（B）的产生。用抗CD3和抗CD28单克隆抗体涂层珠刺激24小时后收集上清液。数据表示至少三个独立实验的平均+SD。C.CD8的细胞溶解活性+效应T细胞在缺氧或常氧条件下进行测量。P815细胞被用作特定靶点。控制，21%O2; 缺氧，1%O2数据表示两个独立实验的平均值。D.和E.在细胞色素b-c1抑制剂0.8μM粘噻唑（myxo）或50 mM 2-DG存在下，用抗CD3和抗CD28单克隆抗体涂层珠刺激IL-2（D）和IFN-γ（E）的产生，通过ELISA进行评估。刺激24小时后收集上清液。数据表示至少五个独立实验的平均值+SD。F.CD8的细胞溶解活性+效应T细胞在2-DG或粘噻唑存在或不存在的情况下进行。数据表示两个独立实验的平均值。与其他研究一样，2-DG对IFN-γ生成和细胞溶解的抑制具有统计学意义（p<0.05），而与粘噻唑或缺氧相比，差异不显著。
图7
图7。氧气不是CD8的主要能源+效应T细胞
A.O的比率2消耗3×107未刺激CD8+效应T细胞。通过添加鱼藤酮（5μM）降低消耗率表明2消耗是通过线粒体介导的。添加N，N，N′，N′-四甲基对苯二胺（TMPD；200μM）和抗坏血酸（A；400μM）反映了O的最大潜力2这些细胞的消耗。数据是两个独立实验的代表。B.CD8中ATP的稳态水平+在指定条件下，用抗CD3和抗CD28涂层珠刺激效应T细胞3小时。控制（ctrl），21%O2，5%一氧化碳2; 缺氧（hyp），1%O2，5%一氧化碳2; 二维（2-DG），50 mM二维，21%O2，5%一氧化碳22-DG的抑制作用具有统计学意义（p<0.001）。数据表示三个独立实验的平均值+SD。
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