Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells

doi:10.1091/mbc.e08-06-0564

.2008年11月；19(11):4930-41.

doi:10.1091/mbc.e08-06-0564。 Epub 2008年9月10日。

整合素介导的蛋白激酶A在迁移细胞前沿的激活

Chinten J Lim公司¹, 克里斯汀·凯恩, 尤金·特卡琴科, 劳伦斯·E·金手指, 埃德加·古铁雷斯, 迈克尔·D·艾伦, 亚历克斯·格罗斯曼, 金章（Jin Zhang）, 马克·H·金斯伯格

附属公司

PMID： 18784251
预防性维修识别码：项目经理2575143
内政部： 10.1091/mbc.e08-06-0564

整合素介导的蛋白激酶A在迁移细胞前沿的激活

Chinten J Lim公司等人。分子生物学细胞. 2008年11月.

.2008年11月；19(11):4930-41.

doi:10.1091/mbc.e08-06-0564。 Epub 2008年9月10日。

作者

Chinten J Lim公司¹, 克里斯汀·凯恩, 尤金·特卡琴科, 劳伦斯·E·金手指, 埃德加·古铁雷斯, 迈克尔·D·艾伦, 亚历克斯·格罗伊斯曼, 金章（Jin Zhang）, 马克·金斯伯格

附属

¹加利福尼亚大学圣地亚哥分校医学系，美国加利福尼亚州拉霍亚92093-0726。

PMID： 18784251
预防性维修识别码：项目经理2575143
内政部： 10.1091/mbc.e08-06-0564

摘要

cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）在需要局部细胞突起的过程中很重要，例如细胞迁移和轴突路径寻找。在这里，我们使用膜靶向PKA生物传感器来揭示迁移细胞前沿PKA的激活。以前的研究表明，PKA活性促进细胞突起和有效迁移。在活迁移细胞中，膜相关PKA活性在前缘最高，需要连接整合素，如α4beta1或α5beta1和完整的肌动蛋白细胞骨架。α4整合素是I型PKA特异性A激酶锚定蛋白，我们现在发现I型PKA-对α4β1整合素介导的PKA活化在前沿的定位很重要。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-激酶）的3'磷酸化磷脂酰肌苷[PtdIns（3,4,5）P（3）]产物的积累是建立迁移方向性的早期事件；然而，极化PKA活化并不需要PI3-激酶活性。相反，PKA的抑制阻止了PtdIns（3,4,5）P（3）结合蛋白的积累，即AKT-pleckstrin同源性（PH）结构域位于前沿；因此，PKA在迁移过程中参与维持细胞极性。总之，我们已经观察到迁移细胞中的室特异性PKA激活，并用它揭示了粘附介导的PKA局部激活是细胞定向迁移的早期步骤。

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数字

**图1。**
通过pmAKAR3观察极化细胞中PKA活性的空间分布。表达（A）pmAKAR3或（B）pmAKAR3（TA）的CHO-α4细胞以低密度铺板在α4β1-特异性配体CS1上，并在图像采集前粘附30分钟。伪彩色FRET图像显示（顶部），带有相应的YFP/CFP发射比值彩色编码标尺。相应的YFP发射图像如下图所示，以供参考。黄色箭头表示延时成像可见的突出行为区域。在T=0时用25μM forskolin刺激细胞。（C）计算整个细胞面积的FRET比值（如A和B所示），并根据指示的时间点绘制。描述的是三次重复测量（n=3个细胞）数据的平均值和SD。（D）在成像前，将表达pmAKAR3的CHO-α4细胞以低密度铺板在CS1上15分钟。如图所示的代表性细胞是基于缺乏极化形态而选择的。

**图2。**
迁移到划痕诱导伤口的细胞中的PKA活性梯度。（A）表达pmAKAR3的CHO-α4细胞CS1-粘附单层被刮伤，15分钟后通过延时显微镜成像。在T=0时添加30μM H89前后采集图像。（B） A中所示电池的线路剖面扫描图，电池的前后方向如图所示x-轴。如图所示，以−30 s（i）和120 s（ii）为中心的五个连续图像帧（5 s间隔）的平均FRET比值如A所示。误差条是标准偏差。（C）单层内嵌入细胞的典型FRET图像，位于伤口边缘后两到三排。

**图3。**
PKA在前缘的激活依赖于整合素。（A）粘附在CS1上并表达pmAKAR3的CHO-α4细胞单层受到损伤，如图所示，在2μg/ml HP2/1（抗α4）或PB1（抗β5）单克隆抗体存在下允许迁移。（B）粘附在纤维连接蛋白上并表达pmAKAR3的CHO细胞单层受到损伤，如图所示，在2μg/ml HP2/1或PB1单克隆抗体存在下允许迁移。

**图4。**
前缘PKA的整合素α4β1特异性激活依赖于I型PKA。（A）野生型或*prkar1a型*用pmAKAR3转染稳定表达α4β1整合素的−/−小鼠胚胎成纤维细胞，粘附在CS1上，作为分离细胞成像。黄色箭头表示细胞突起区域。（B）所示的剖面图是以白线追踪为中心的六次平行线扫描的平均比率值，如图A所示，图中显示了前后单元方向x-轴。（C）双转染mcherry-mitoAKB-RI（C）或mcherry-mitoAKB-RII（D）和pmAKAR3的CHO-α4细胞作为单层粘附在CS1上，通过损伤诱导迁移。mitoAKB构建表达I型或II型特异性PKA结合肽，将相关PKA亚型隔离到线粒体。

**图5。**
PKA活性的富集发生在细胞突起处，需要肌动蛋白聚合。（A）使用微流体室在玻璃盖玻片上涂上Alexa647标记的CS1基板，其为5μm宽的条带（蓝色），中间点缀着未涂覆的玻璃表面（图1中为黑色）。所示为粘附在微图案基底上并沿着CS1涂层表面延伸突起的表达pmAKAR3的代表性CHO-α4细胞。如图所示，伪彩色FRET图像覆盖在涂层图像上，以便于其与细胞对齐。（B）在T=0时用1μM latrunculin-A处理一个分离的粘附性pmAKAR3-转染CHO-α4细胞，并进行FRET成像。黄色箭头表示延时图像序列中可见的细胞突起区域。所示剖面图是以白线追踪为中心的六次平行线扫描的平均比率值。

**图6。**
前沿的PKA激活独立于PI3激酶活性，并参与细胞迁移过程中GFP-PH-Akt的积累。（A）对表达pmAKAR3的CS1上的CHO-α4细胞单层进行损伤，然后用30μM LY294002治疗15分钟，并在持续存在抑制剂的情况下进行成像。（B）将表达GFP-PH-Akt的CHO-α4细胞的创伤单层固定在CS1上并成像，以观察PtdIns（3,4,5）P的积聚_三将粘附在CS1上的（C和D）CHO-α4细胞单层损伤，允许其迁移15分钟，然后用30μM LY294002、30μM H89处理，或在固定和染色C磷酸化的PKA底物[p（S/T）底物PKA]和（D）磷酸化的α4（磷酸化-α4）之前再处理15分钟。由黄色矩形包围的区域的底部放大和合并图像。（E）将CHO-α4细胞粘附在纤维连接蛋白包被的微孔上达指定时间，通过SDS-PAGE进行裂解、分离，并进行免疫印迹以检测丝氨酸473（pS473-Akt）处的Akt磷酸化。用识别Akt总蛋白的抗体重复印迹。LY，LY294002。（F）为了确保H89抑制PKA的效果，在有或无H89的情况下用50μM Fsk处理细胞，并用磷酸化PKA底物抗体进行免疫印迹。

**图7。**
极化细胞表现出前后cAMP梯度。（A）表达ICUE2（一种基于FRET的cAMP结合生物传感器）的CHO-α4细胞在CS1上作为单层生长，如上文所述进行损伤和成像。如图所示的伪彩色编码方案是CFP除以YFP发射比，以反映该报告者在cAMP结合时表现出FRET丢失的事实。（B） A中所示电池的线路剖面扫描图，电池的前后方向如图所示x-轴。剖面图是六行扫描的平均比率值和数据分布，如插图所示。（C）比率图像被细分为四个区域，如插图所示，并在这些区域内随机采样比率值（每个区域n=5）。误差线是标准偏差和p值，使用学生的配对t吨测试，显示用于指示的比较。

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