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。2008年10月；118(10):3355-66.
doi:10.1172/JCI35298。

FGF系统在调节血管完整性方面发挥着关键作用

村上雅弘 1, 阮湖, 郑维庄, 卡伦·穆迪, 皮特·卡梅里特, Radu V Stan公司, 迈克尔·西蒙斯
附属公司

FGF系统在调节血管完整性方面起着关键作用

村上雅弘等。 临床研究杂志。 2008年10月。

勘误表in

  • 临床投资杂志。2009年7月；119(7):2113. 张振伟[改为庄振伟]

摘要

内皮单层的完整性对于血管内稳态和内皮通透性的积极调节至关重要。FGF系统在多种生理和病理条件中发挥重要作用；然而，其在成人血管系统中的作用尚未明确。为了评估FGF系统在成人内皮单层中的作用，我们使用可溶性FGF陷阱或所有FGF受体的主要抑制剂在体外破坏牛主动脉内皮细胞和人隐静脉内皮细胞以及在体内破坏成年小鼠和大鼠内皮细胞中的FGF信号。使用这些方法抑制FGF信号传导导致VE钙粘蛋白/p120连环蛋白复合物的解离和粘附物和紧密连接的分解，从而导致内皮细胞的损失、内皮屏障功能的严重损伤，最后导致血管系统的解体。因此，FGF信号在维持血管完整性中起着关键作用。

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数字

图1
图1。sFGFR系统的验证。
(A类)sFGFR在体外以剂量依赖的方式阻断FGF诱导的Erk1/2磷酸化。在BAEC中转导Ad-GFP和Ad-sFGFR1IIc，并用指定浓度的FGF1刺激10分钟。对总细胞裂解物进行Western印迹。p-Erk1/2，磷酸-Erk1/2；t-Erk1/2，总Erk1/2；VP，病毒颗粒。(B类)sFGFRs有效抑制FGF1诱导的Erk1/2活化。在BAEC中转导Ad-Null、Ad-sFGFR1IIIc、Ad-sFGFR3IIIb和Ad-sFGFR 3IIIc，并用FGF1刺激5分钟。(C类)sFGFR3IIIb不抑制FGF2诱导的Erk1/2激活。在BAEC中转导Ad-Null和Ad-sFGFRs，并用FGF2刺激5分钟。(D类)小鼠sFGFR的血浆表达水平。Ad-Null（控制）或Ad-sFGFR1IIc（5×1010将病毒颗粒）注射到C57BL/6小鼠体内，并在指定的时间点采集血样。用检测人IgG-Fc的ELISA系统测定sFGFR水平。数据显示为平均值±SD，n个=每组4人。(E类)sFGFR的组织分布。Ad-Null（对照）或Ad-sFGFR1IIIc注射10天后（5×1010收集组织样本并提取总蛋白。随后，进行ELISA检测人类IgG-Fc。数据显示为平均值±SD，每组4只动物。(F类)注射sFGFR后体重变化。用腺病毒（5×10）注射Ten-week-old C57BL/6小鼠10病毒颗粒），每周测量体重。数据显示为平均值±SD，n个=每组4人*P（P）<0.05，学生的t吨测试。
图2
图2。缺乏FGF信号的小鼠血管完整性受损。
(A类)sFGFR1IIIc小鼠的血管通透性增加和内皮形态受损。腺病毒注射C57BL/6小鼠10天后，对气管血管进行CD31（红色）染色。绿色代表血管外空间中的微球。比例尺：20μm（左侧面板）；10μm（右侧面板）。(B类)sFGFR1IIc增加肌肉的血管通透性。在C57BL/6小鼠中注射Ad-Null（对照）或Ad-sFGFR，14天后，静脉注射Evans蓝染料。取内收肌群肌肉进行定量。数据显示为平均值±SD(n个= 4). *P（P）<0.05，对照组vs.sFGFR1IIct吨测试。(C类)抑制心脏和肺中的FGF信号可增加血管通透性。在C57BL/6小鼠中注射Ad-Null（对照）和Ad-sFGFR，10天后，检测心脏和肺部的Evans蓝染色水平。数据显示为平均值±SDn个=7，对照；n个=8，sFGFR1IIIc；n个=4，sFGFR3IIIb；n个=4，sFGFR3IIIc*P（P）<0.05，与对照组相比t吨测试。(D类)Ad-sFGFR1IIc治疗的裸鼠血管通透性增加。NU/NU裸鼠（Charles River Laboratories）接受气管CD31。在Ad-sFGFR1IIc处理的气管血管系统中，对照组（箭头）中观察到的连接CD31染色完全缺失。比例尺：20μm（左侧面板）；10μm（右侧面板）。(E类)Ad-sFGFR1IIc治疗的小鼠肺和心脏出现出血。腺病毒注射裸鼠10天后，取肺和心脏进行H&E染色。上面板显示肺部部分，下面板显示心脏部分。黑色箭头表示心肌出血。原始放大倍数，×400。
图3
图3。内皮中FGF抑制的体内效应。
(A类)用Ad-Null或Ad-FGFR1DN（109PFU）。用腺病毒转导动脉段，并对其进行VE-cadherin染色（红色），显示1μm Z-Stack切片的最大强度投影。在第5天，内皮细胞失去了细胞与细胞的接触，细胞之间形成了间隙。比例尺：10μm。(B类)暴露于全身Ad-Null或Ad-sFGFR1IIc病毒的小鼠颈动脉和颈静脉。对动脉段进行VE-cadherin染色，并显示1μm Z-Stack截面的最大强度投影。比例尺：20μm。
图4
图4。抑制FGF对内皮细胞的影响：电子显微镜分析。
(A类)Ad-Null转导大鼠股动脉的扫描电镜分析。动脉壁显示由于下方平滑肌细胞收缩而形成的脊状结构（顶部面板，比例尺：50μm）。Ad-Null感染动脉的高倍放大细节显示出连续的内皮单层（底部面板，比例尺：10μm）。(B类)Ad-FGFR1DN转基因大鼠股动脉的SEM分析。显示剩余内皮细胞的区域（左侧面板，比例尺：50μm[顶部]；10μm[底部]）。内皮细胞肿胀，与邻近细胞失去联系。底层矩阵层部分暴露（白色箭头）。图中还显示了内皮细胞严重丧失并暴露于下层基底膜的区域（右侧面板，比例尺：50μm[顶部]）。高倍镜下可见一些细胞，可能是血小板大小，粘附在血管壁上（白色箭头）（右侧面板，比例尺：10μm[底部]）。(C类)Ad-Null转基因大鼠股动脉的透射电镜分析（第2天）。相邻的内皮细胞形成一个紧密密封的连接，如黑色箭头所示。比例尺：500 nm。(D类)Ad-FGFR1DN–转导动脉（第1天）。比例尺：2μm。插图：内皮细胞之间形成缝隙。箭头（插图）表示开放的细胞-细胞连接。比例尺：500纳米。(E类)Ad-FGFR1DN–转导的动脉（第2天）显示开放的内皮连接（黑色箭头）。血小板（PLT）粘附在开放空间并延伸细胞过程（白色箭头）。比例尺：500 nm。(F类)Ad-FGFR1DN–转导的动脉显示内皮细胞有一个大缺口（黑色箭头），EC从基底膜上脱落。比例尺：2μm。
图5
图5。缺乏FGF信号的细胞内皮通透性增加。
(A类)ECIS系统评价内皮单层通透性。腺病毒转导开始后48小时内，每5分钟测量一次阻抗。腺病毒暴露后，将细胞培养基改为正常生长培养基。n个=每组3人，对<0.05，对照组与48小时时的FGFR1DN或sFGFR1IIc(B类)使用各种sFGFR腺病毒进行ESIS分析。腺病毒暴露后，用正常生长培养基代替培养基。n个=每组3人，P（P）<0.05，对照组与48小时时的sFGFR1IIIc或sFGFR3IIIc(C类)使用高（2 MDa）和低（70 kDa）分子量右旋糖酐的Transwell示踪实验。转导Transwell室上完全汇合的BAEC，并在上部室中添加右旋糖酐。使用荧光微孔板阅读器在指定的时间点测量下室中的荧光值。进行了三个独立的实验。一个代表性实验显示为平均值±SDn个=每组3人*P（P）<0.05（学生）t吨测试、控制vs.FGFR1DN。AU表示荧光的相对强度。(D类)使用Ad-sFGFRs的Transwell示踪实验。数据显示为平均值±SDn个=每组3人*P（P）<0.05（学生）t吨测试、控制vs.sFGFR1IIc。
图6
图6。在缺乏FGF信号的细胞中，细胞间接触缺乏连接蛋白。
(A类)静止和完全融合内皮单层的免疫染色。使用低MOI（分别为10和25）用Ad-GFP或Ad-FGFR1DN-GFP转导BAEC，以限制转导细胞的数量并最小化病毒介导的毒性。24小时后对细胞进行VE-cadherin（红色）和β-catenin（绿色）染色。Ad-FGFR1DN-GFP载体有一个双向启动子编码GFP和FGFR1DN，从而用GFP标记转导细胞（以白色显示）。注意FGFR1DN-GFP-转导细胞的细胞间接触处VE-cadherin和β-catenin染色缺失。箭头指向相邻FGFR1DN-GFP-转导细胞之间的间隙。比例尺：20μm。(B类)用Ad-Null或Ad-sFGFR1IIc转导的静态内皮单层（BAEC）的免疫染色。对细胞进行VE-cadherin（红色）、p120-catenin（绿色）和DAPI（蓝色）染色。sFGFR在培养基中分泌；这种作用并不局限于转导的细胞。箭头表示内皮细胞之间的间隙。比例尺：20μm。
图7
图7。紧密连接和静脉细胞同样受到FGF信号抑制的影响。
(A类)用Ad-GFP或Ad-FGFR1DN-GFP转导的静态内皮单层（BAEC）的免疫染色。对细胞进行VE-cadherin（红色）和ZO-1（绿色）染色。Ad-FGFR1DN-GFP载体有一个双向启动子，编码如上所述的GFP和FGFR1DN（GFP信号以白色显示）。箭头显示VE-cadherin和ZO-1染色减少以及内皮细胞之间的间隙。比例尺：20μm。(B类)静止静脉内皮单层的免疫染色。用Ad-GFP或Ad-FGFR1DN-GFP转导HSVEC，24小时后对其进行VE-cadherin（红色）和p120-catenin（绿色）染色。注意细胞间接触处VE-cadherin和p120-catenin染色的丢失，以及FGFR1DN-GFP-转导细胞的细胞间隙的形成（白色箭头）。比例尺：20μm。
图8
图8。FGF治疗在体外维持EC连接并降低内皮通透性。
(A类)使用汇合单层进行ECIS渗透性分析。BAEC成熟至完全融合，培养基替换为EBM-2（Cambrex）中1%的BSA。在指定的时间点（箭头）添加FGF1（1 ng/ml）或1%BSA/EBM-2。6小时后，在指定的时间点（箭头）添加VEGF-A（25 ng/ml）或1%BSA/EBM2。在6小时时，与对照组相比，FGF处理显著增加了单层阻抗。(B类)FGF治疗不会诱导内皮细胞单层的连接破坏。BAEC成熟到完全融合，在EBM-2中用1%的BSA饥饿48小时，用FGF1（50 ng/ml）或VEGF（80 ng/ml。比例尺：20μm。
图9
图9。FGF对VE-cadherin/p120-catenin相互作用和VE-cadherin质膜滞留的依赖性。
(A类)Ad-FGFR1DN–转导的BAEC中细胞表面VE-粘附素减少。用Ad-GFP或Ad-FGFR1DN转导静态BAEC，并用生物素处理单层以标记细胞表面蛋白。对生物素化蛋白进行Western blot分析，并检测VE-cadherin或N-cadherin。对相同样品的总细胞裂解物也进行Westernblot分析以评估总蛋白表达。(B类)连接蛋白表达的Western blot分析。在指定的时间点采集转导的BAEC，并通过Western blotting分析总细胞裂解物。(C类)FGF处理对VE-cadherin与catenins相互作用的影响。BAEC单层在0.5%FBS基础培养基中保存24小时，然后用FGF1（50 ng/ml）刺激指定时间。用抗VE-cadherin抗体免疫沉淀总细胞裂解物，并用p120-catenin、β-catenin或VE-cadherin抗体印迹。(天)VE-cadherin与catenins相互作用的FGFR信号要求。用Ad-GFP或Ad-FGFR1DN转导亚流入BAEC单层（约70%合流），细胞生长形成成熟连接。在指定的时间点，制备总细胞裂解物，并用VE钙粘蛋白抗体进行免疫沉淀，然后用p120连环蛋白、β-连环蛋白或VE钙粘蛋白抗体进行免疫印迹。随着单层形成成熟的连接，VE-cadherin/p120-catenin相互作用增加（Ad-GFP），而Ad-FGFR1DN处理的细胞中这种相互作用减少。在细胞裂解之前，用100μM PV处理未转导细胞10分钟，显示VE-cadherin/p120相互作用受到干扰。
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