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.2008年10月；7(10):1630-40.
doi:10.4161/cbt.7.10.6585。 Epub 2008年10月9日。

曲妥珠单抗和17-AAG联合诱导ErbB2过度表达乳腺癌细胞泛素化和溶酶体途径依赖性ErbB2-降解增强及细胞毒性

斯里库马尔·拉贾 1, 罗伯特·J·克鲁布, 米特拉·巴塔查里亚, 曼哈里·迪姆里, 郝成, 韦潘（Wei Pan）, 塞萨尔·奥尔特加·卡瓦, 阿拉加萨米·拉库·雷迪, 马尤米·纳拉穆拉, Vimla波段, 哈米德带
附属公司

曲妥珠单抗和17-AAG联合诱导ErbB2过度表达乳腺癌细胞泛素化和溶酶体途径依赖性ErbB2-降解增强及细胞毒性

Srikumar M Raja公司等。 癌症生物治疗. 2008年10月.

摘要

乳腺癌中ErbB2（或Her2/Neu）过度表达意味着预后较差，但人源化单克隆抗体曲妥珠单抗（Herceptin）的成功证明，它为靶向治疗提供了一条途径。然而，在大多数情况下，对曲妥珠单抗的耐药性和最终的失败需要替代ErbB2靶向治疗。HSP90抑制剂，如17-烯丙基胺脱甲氧基高达霉素（17-AAG），能有效下调细胞表面ErbB2。虽然曲妥珠单抗或17-AAG作用的确切机制尚不清楚，但ErbB2的泛素依赖性蛋白酶体或溶酶体降解似乎发挥了重要作用。由于曲妥珠单抗和17-AAG分别诱导不同的E3泛素连接酶Cbl和CHIP募集到ErbB2，我们假设与单药治疗相比，17-AAG和曲妥珠单抗组合可以诱导更高水平的泛素化和ErbB2的下调。我们提出了生化和细胞生物学证据，即17-AAG和曲妥珠单抗联合治疗ErbB2过度表达的乳腺癌细胞株会导致泛素化增强、细胞表面的下调和ErbB2的溶酶体降解。重要的是，17-AAG和曲妥珠单抗联合治疗可诱导协同生长停滞和细胞死亡，特别是在ErbB2-过度表达的乳腺癌细胞中，但在ErbB2-low乳腺癌细胞内没有。我们的结果表明，17-AAG和曲妥珠单抗联合应用是一种基于机制的组合靶向治疗ErbB2过度表达乳腺癌患者的方法。

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数字

图1
图1。低浓度17-AAG与曲妥珠单抗联合诱导更有效的ErbB2-降解
A、 B类17-AAG和曲妥珠单抗诱导的ErbB2下调的差异动力学；在指定的时间段内，用100 nM 17-AAG（A）或10μg/ml曲妥珠单抗（B）处理SKBr-3和21MT-1细胞，然后进行细胞裂解。用SDS-PAGE/WB分析50μg等分的细胞裂解液。Hsc70用作加载控制。C类在17-AAG的高浓度下，曲妥珠单抗和17-AEG之间的协同作用不明显；在指定的时间段内，用17-AAG（100 nM）单独处理SKBr-3细胞，用17-AAG（100nM）+T（10μg/ml）或T（10微克/毫升）处理。用SDS-PAGE/WB分析细胞和25μg等分样品，并探测ErbB2和β-肌动蛋白（负荷控制）。D类17-AAG和曲妥珠单抗的组合在ErbB2的降解中更有效；将SKBr-3或21MT-1细胞单独用17-AAG（10 nM）或Trastuzumab（T）单独用（10μg/ml）或联合用（10 nM；10μg/ml）处理24或48小时。细胞也用100 nM 17-AAG处理6小时，作为相对效力的比较。处理后，在含有裂解缓冲液的Triton X-100中对细胞进行裂解。通过SDS-PAGE/Western blotting直接分析50μg小份裂解液，并探测ErbB2。β-肌动蛋白免疫印迹作为负荷控制。E类用SDS-PAGE/WB和密度测定法分析17-AAG和曲妥珠单抗对21MT1细胞ErbB2-降解的影响（±SEM；n=6）
图2
图2。17-AAG联合曲妥珠单抗降低ErbB2的细胞表面水平
A类将生长在6孔板中的21MT-1细胞用DMSO（深红色）、10 nM 17-AAG（紫色）、10μg/ml T（青色）或17-AAG+T（深绿色）处理指定的时间段。还包括100 nM 17-AAG处理（深蓝色）作为对照进行比较。处理后，将细胞胰酶化，在FACS缓冲液中洗涤，并按照方法部分所述对活细胞进行ErbB2染色。使用流式细胞术评估细胞表面水平。B类.21MT-1或SKBr-3细胞生长在玻璃盖玻片上，用指定浓度的17-AAG单独、Trastuzumab单独或组合处理指定时间段。治疗后，将盖玻片固定在4%多聚甲醛（PFA）中，并按照方法部分的详细说明进行ErbB2（绿色）免疫染色。这里显示的是共焦免疫荧光显微镜图像。
图3
图3。17-AAG和曲妥珠单抗联合治疗诱导ErbB2泛素化和溶酶体降解增强
A类.21MT-1细胞用指示浓度的17-AAG或曲妥珠单抗或联合用药处理6h。处理后，细胞裂解并根据前述方法（20）进行抗ErbB2 IP处理。在SDS-PAGE/WB之后，对膜过滤器进行泛素检测。剥离膜过滤器并探测ErbB2。50μg等分总裂解液也进行了类似分析。B类.17-AAG诱导溶酶体中ErbB2的积累；将生长在盖玻片上的21MT-1细胞置于未处理状态（顶行）或用100 nM溶酶体抑制剂bafilomycin A1（中行）或10μM蛋白酶体抑制剂lactacystin（底行）预处理1 h。然后，对细胞进行未处理（左列）或用100nM 17-AAG（右列）处理。治疗后，将盖玻片固定在4%多聚甲醛（PFA）中，并对ErbB2（绿色）和LAMP-1（红色）进行免疫染色，详见方法部分。这里显示的是共焦免疫荧光显微镜图像。C类曲妥珠单抗治疗还诱导ErbB2的溶酶体定位；在固定之前，在盖玻片上生长的21MT-1细胞未经处理或用10μg/ml曲妥珠单抗处理48小时，并对ErbB2（绿色）和LAMP-1（红色）进行免疫染色。D类将生长在盖玻片上的BT-474细胞与指定浓度的单药或联合用药处理指定时间段，加或不加Bafilomycin（10 nM）。处理后的盖玻片按照图3A图例所述进行处理。图示绿色为ErbB2染色，红色为LAMP-1染色；共定位区域显示为黄色。
图4
图4。17-AAG和曲妥珠单抗联合对ErbB2过表达乳腺癌细胞的细胞毒性的协同作用
顶行：对BT-474、SKBr-3和21MT-1进行单药治疗或联合治疗（在剂量-反应曲线中选择的17-AAG浓度下）的效果比较，显示联合治疗相对于单药的疗效。Trastuzumab（T）浓度固定为0.1μg/ml（对于BT-474细胞）或10μg/ml，对于SKBr-3和21MT-1。中间一行：17-AAG和曲妥珠单抗组合的中位效应图。x截距处的箭头表示17-AAG的中位剂量。注意，与17-AAG相比，组合向左移动。最下面一行：不同浓度17-AAG的各种分数效应的组合指数（CI）值。CI<1表示协同作用；CI～1表示加性效应；CI>1表示对抗。
图5
图5。17-AAG和曲妥珠单抗联合作用选择性诱导ErbB2过度表达乳腺癌细胞增殖停滞
A类ErbB2-low细胞包括MCF-10A、MDA-MB-231和MCF-7细胞，在指定浓度下单独或联合使用17-AAG（20 nM）或曲妥珠单抗（10μg/ml）处理，并通过MTT分析评估相对生长。为了进行比较，还使用了MCF-7-ErbB2（逆转录）。B类.用于上述研究的细胞系中ErbB2水平的比较；采用SDS-PAGE/WB分析100μg等分试样的BT-474、SKBr-3、21MT-1、MCF-ErbB2、MCF-7、MCF-10A和MDA-MB-231细胞裂解物。
图6
图6。17-AAG加曲妥珠单抗更有效地诱导细胞周期阻滞和凋亡
A类在24孔板中生长7天的SKBr-3细胞（一式两份）用指示浓度的单一药物或组合处理。药物治疗结束后，将细胞固定并用0.25%结晶紫染料在20%甲醇溶液中染色。这里显示的是一个具有代表性的板块。B类17-AAG和曲妥珠单抗联合诱导ErbB2过度表达细胞中的G1-受体；将P100平板中生长的SKBr-3细胞按指示处理（一式三份）2天，然后进行细胞周期分析。这里显示了每种情况下具有代表性的细胞周期分析概况。还显示了每个阶段的细胞百分比（±S.D.）。与单独使用17-AAG（p<0.01）或Trastuzmab（p<0.05）相比，联合用药可显著提高G1-arrest的疗效。C类药物处理的SKBr-3细胞的膜联蛋白V测定；用二甲基亚砜或17-AAG（10 nM）、曲妥珠单抗（1或10μg/ml）或17-AEG（10 nM）加曲妥珠单抗（1或者10μg/ml）处理生长在P100平板中的SKBr-3细胞（一式三份）5天。药物治疗后，根据制造商的方案对细胞进行胰蛋白酶化，并对细胞进行Annexin V染色，以评估死亡/死亡细胞。实验结束时，部分样品用于ErbB2水平的SDS-PAGE分析。此处显示了Annexin V阳性细胞±S.D的百分比。插图显示治疗结束时的ErbB2水平。D类ErbB2-过表达乳腺癌细胞的单一或组合治疗对ErbB2下游信号传导的影响；BT-474细胞用指定浓度的单一药物或组合治疗3天。用SDS-PAGE/WB分析100μg细胞裂解物蛋白等分样品的促生存信号、p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K、cyclin D1和survivin。
图7
图7。本研究假设的示意图
箭头的厚度代表了再循环相对于溶酶体靶向的相对优势，点状箭头是最不占优势的路径。A类.通过heregulin（HRG）激活的ErbB2流量的正常循环（实心箭头）路线，HRG与ErbB3/4结合并通过异构化激活ErbB2。B类抗-ErbB2抗体通过Cbl募集和增加溶酶体靶向性（和减少再循环）诱导ErbB2下调。C类我们的模型研究了17-AAG与HSP90结合如何激活CHIP，通过溶酶体靶向促进ErbB2下调。D类我们的假设是，结合Cbl（针对抗ErbB2）和CHIP（针对17-AAG）泛素化途径，将通过转换为主要的溶酶体命运（实心箭头）而非循环（点状箭头），导致ErbB2.协同下调。
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