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。2008年10月；131（第10部分）：2564-78。
doi:10.1093/brain/awn198。 Epub 2008年8月30日。

持续炎症改变内源性脑干细胞室的功能

斯特凡诺·普卢奇诺 1, 卢卡·穆齐奥, 詹姆·伊米托拉, 米歇拉·德莱迪, 克拉拉·阿尔法罗·塞韦洛, 朱利安娜·萨拉尼, 克里斯蒂娜·波切里, 埃琳娜·布兰比拉, 弗朗西丝卡瓦西尼, 安德烈亚·贝加马斯基（Andrea Bergamaschi）, 何塞·曼努埃尔·加西亚-维尔杜戈, 吉安卡洛·科米, 萨米亚·J·库里, 詹维托·马蒂诺
附属公司

持续炎症改变内源性脑干细胞室的功能

斯特凡诺·普卢奇诺等。 大脑。 2008年10月。

摘要

内源性神经干/前体细胞（NPC）被认为是促进组织内环境稳定和损伤后修复的功能库，因此最近提出了动员这些细胞的再生策略。尽管有证据表明急性炎症损伤（如缺血性中风）后神经发生增加，但慢性中枢神经系统炎症性疾病中内源性脑干细胞室的可塑性仍不明显。在这里，我们表明，以髓磷脂为靶点的免疫细胞诱导的持续性脑炎症广泛改变了脑室下区（SVZ）NPC在体内的增殖和迁移特性，导致非迁移神经母细胞在SVZ生发龛内大量积聚。同时，我们证明了持续性脑炎症期间SVZ中假定的脑干细胞增殖的定量减少，这在分离NPC的体外培养后完全逆转。总之，这些数据表明，炎症性脑微环境维持了内源性中枢神经系统干细胞室的非细胞自主功能障碍，并对旨在动员慢性炎症性脑疾病内源性前体的拟议疗法的潜在疗效提出了挑战。

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数字

图1
图1
慢性自身免疫性CNS炎症损害SVZ常驻NPC的增殖体内. (A类)M期限制性磷酸化组蛋白H3（pH3）降低+在20、30和60dpi的EAE小鼠SVZ中观察到细胞。图表中的数据表示为pH3-免疫活性细胞/切片±SEM的平均数，从以下总数中获得n个每组≥5只小鼠*P（P）与HC相比，≤0.05。pH3的两个代表性图像+显示HC和EAE 30 dpi SVZ中的细胞。标尺50μm。(B–E类)HC小鼠背外侧SVZ冠状切片(B类和D类)和EAE为30 dpi的小鼠(C类和E类)显示快速增殖的IddU+单元格（绿色B类和C类)，IddU+/伊巴1+（绿色和红色B类和C类）和CD45+/Ki67号机组+（绿色和红色D类和E类EAE和HC中的细胞。箭头表示Iddu——/伊巴1+两个面板中的单元格。比例尺：50μm。(F类)在30 dpi的EAE小鼠SVZ中观察到长期BrdU保留细胞减少。小鼠从13或30 dpi开始接受BrdU治疗6天，并在最后一次注射BrdU 40天后处死。数据表示为BrdU的平均数+细胞/截面±SEM，并从总计n个每组≥3只小鼠n个≥2个独立实验*P（P）与HC相比，≤0.001。两张具有代表性的共聚焦显微镜照片显示了长期保持的BrdU+（红色）GFAP+显示HC和EAE 30 dpi SVZ的（绿色）单元格。(G公司)表达mRNA的SVZ细胞减少PDGFrα在20 dpi的EAE小鼠SVZ中观察到。PdgfRαmRNA由位于SVZ内的假定型慢分化细胞以及广泛分布于成人脑实质内的OPC表达（上图中的箭头）。数据表示为PDGFrα+细胞/截面±SEM，并从总计n个每组≥3只小鼠。比例尺：50μm。细胞核在(B–G类)已用DAPI复染。左心室，侧脑室。
图2
图2
慢性自身免疫性中枢神经系统炎症损害SVZ生发生态位的细胞组织。(A类)30（b）和60 dpi（c）时HC（a）和EAE小鼠SVZ沿线的细胞组织图。代表性区域以较高的放大倍数显示。注意HC中的均质组织，而EAE小鼠在30 dpi时，细胞积累并形成大细胞簇。这些簇倾向于在60 dpi时恢复。室管膜细胞为黑色，SVZ细胞为灰色；(B类)在30dpi下的EAE SVZ区域的透射EM。迁移神经母细胞链(A类)出现在侧脑室（LV），以不连续的线分隔。室管膜细胞覆盖心室壁(E类); (C类)30 dpi的EAE小鼠表现出大细胞簇，由多层累积迁移细胞组成(A类); (D类)HC SVZ显示一组同质的迁移神经母细胞(A类). 箭头表示A型细胞之间的典型自由空间，在EAE小鼠中变得不太明显；(E类)单个B型细胞或星形胶质细胞的代表性图像(B类)通过膨胀接触心室（LV）（箭头所示）。这些星形胶质细胞可能被激活以响应增殖信号，并趋向于在EAE小鼠的SVZ内消失；(F类)单个小胶质细胞（Mi）的代表性图像。其中一些细胞充满致密体，通常位于血管（BLV）附近，在10–30 dpi时，EAE小鼠的SVZ趋于增加；(G公司)EAE小鼠SVZ中的Picnotic细胞（Pic）短暂增加。比例尺英寸B类,C类和D类：5μm，当处于E类和F类：2微米。
图3
图3
慢性自身免疫性CNS炎症损害SVZ成神经细胞的迁移。(A–C)EAE小鼠30岁时RMS的代表性甲苯胺蓝染色半薄切片(A类)和60 dpi(B类)和HC(C类). 取下相同的切片，重新切割超薄切片。在EM上对细胞进行了研究，并将其鉴定为成神经细胞或星形胶质细胞（下部面板中为红色和绿色）。注意30 dpi时EAE小鼠RMS的紊乱(A类)迁移神经母细胞和大量星形胶质细胞的数量极低。60 dpi时EAE小鼠的RMS表现出恢复正常形态的趋势(B类)，与HC相比(C类). 30 dpi处的箭头显示小胶质细胞（紫色）。比例尺：20μm。(D类)从具有代表性的HC（左侧面板）和EAE为30 dpi的鼠标（右侧面板）对整个RMS进行矢状重建。PSA-NCAM（红色）检测到迁移神经母细胞，而GFAP（绿色）检测到星形胶质细胞。注意正常PSA-NCAM+HC小鼠中的迁移细胞链（左侧面板）。相比之下，PSA-NCAM+30 dpi时，EAE小鼠RMS中的细胞在向嗅球迁移的过程中出现紊乱（右图）。EAE小鼠的GFAP数量也增加+RMS周围薄壁组织内的星形胶质细胞。冠状切面显示迁移链明显紊乱，PSA-NCAM较少+EAE小鼠背部SVZ水平的成神经细胞（放大插图中的紫色细胞）。放大插图中的细胞核已用DAPI进行了复染。比例尺：50μm。LV=侧脑室。(E–J)冠状脑切片显示PSA-NCAM（红色）和NG2（绿色）的双重免疫荧光E类和F类)或Olig2（绿色G公司和H（H）). 注意，在30 dpi的EAE小鼠中，NG2和Olig2都没有共同染色(F类和H（H）)和HC(E类和G公司). 在我和J型，HC小鼠的NeuN染色（绿色）(我)在EAE小鼠中(J型)分别为30 dpi。请注意，这两只小鼠的SVZ（周围有一条连续的线）中几乎没有细胞染色，而大多数纹状体神经元染色（箭头）。在所有面板中，用DAPI对细胞核进行了复染，标尺为100μm。
图4
图4
逆转录病毒细胞追踪显示SVZ子代的迁移行为受损。(A类)将表达绿色荧光蛋白（GFP）的复制缺陷型逆转录病毒立体定向注射到侧脑室，感染S期局限性细胞。绿线表示针迹，红线表示RMS。注射19天后，GFP+沿着RMS迁移的细胞在从前SVZ到OB的区域中被编号。OB，CTX=皮层；LV=侧脑室。(B类)EAE小鼠表现出GFP亚群的显著减少+细胞迁移至OB和非迁移GFP增加+与HC相比，检测到的细胞非常接近SVZ。数据表示为从n个=每组3只小鼠*P（P）≤ 0.05. (C–F类)GFP公司+在SVZ衬里和HC的OB中检测到细胞（绿色）(C类和D类)20 dpi时的EAE(E类和F类). 中的箭头C类和E类表示SVZ GFP+细胞。箭头指向D类和F类显示OB GFP+细胞。细胞核用DAPI复染。比例尺：150μm。左心室，侧脑室。
图5
图5
慢性自身免疫性中枢神经系统炎症小鼠的神经球显示自我更新减少。(A类)HC（黑圈）和CFA免疫对照组（白圈）以及EAE小鼠（灰圈）克隆效率的定量分析。注意，与对照组相比，在20、30、60、120和240 dpi时，EAE小鼠初级神经球的克隆效率显著且持续受损。(B类)EAE小鼠原代神经球的克隆效率在n个=10次放大在体外它是HC和CFA免疫对照组。每个实验组共有三到六只小鼠在每个时间点进行分析。数据表示为平均克隆效率±SEM，总计n个≤3个独立实验**P（P）≤0.0001。(C–E类)基于神经集落形成细胞（NCFC）分析的(C类)，中等-(D类)和小型(E类)殖民地。注意，与HC（黑条）相比，EAE小鼠的大中型菌落显著且持续减少，而小菌落增加（灰条）。数据表示为菌落±SEM的平均百分比占总电镀细胞数的百分比n个≥3个独立实验。每个实验组共有6只小鼠在每个时间点进行分析*P（P）≤ 0.05; °P（P）≤ 0.005. Ø，菌落直径。
图6
图6
CNS炎症在mRNA水平诱导细胞周期调节器和神经源性转录因子的表达。(A类,B类)对选定的mRNA进行半定量分析。中的图形A类包括以下列表n个=与CFA免疫对照组相比，EAE小鼠SVZ中的5个选定基因在任何时间点均表现出显著下调（倍数减少≥1）。中的图形B类包括以下列表n个=与CFA免疫对照组相比，EAE小鼠SVZ中的15个选定基因在任何时间点均表现出显著上调（折叠诱导≥1）。(C–F类)现场杂交直径x2(C类和D类)和Cdkn1a/p21(E类和F类)在两个HC的冠状脑切片上(C类和E类)和EAE 30 dpi(D类和F类). EAE小鼠显示直径x2+和Cdkn1a/p21+与HC相比，SVZ内的细胞。在暗场光学显微镜下用20倍物镜捕获放射自显影颗粒（红色），并通过DNA染色（DAPI，蓝色）观察组织。LV=侧脑室。比例尺：50μm。(G–I型)IFN-γ和TNF-αmRNA水平显著升高(G公司和H（H）与CFA免疫对照组相比，EAE小鼠在20和30 dpi时的SVZ中。中的图形F类显示出IL-1β20和30dpi时EAE小鼠SVZ中的mRNA水平。数据表示为平均任意单位±SEM，并从以下SVZ中获得n个每只小鼠每组每时间点≥6只*P（P）≤ 0.05; **P（P）≤ 0.0001.
图7
图7
慢性CNS炎症导致神经干细胞静止在体外和体内. (A类)在存在Th1细胞因子（IFN-γ，500 U/ml；TNF-α，200 U/ml，IL-1β100 U/ml）或Th2细胞因子（IL-4、IL-5和IL-13，均为10 ng/ml）的情况下，对主要SVZ NPC进行NCFC分析。在最后48小时（白色条）或整个试验期间（黑色条），SVZ细胞以克隆密度接种在富含细胞因子的NeuroCult中。用Th1或Th2细胞因子处理48小时后，所生成的菌落百分比没有差异，而较长时间（3周）的Th1细胞因子处理导致大菌落生成完全失败。数据表示为菌落/大小占总电镀细胞±SEM的平均百分比，从以下总数中获得n个≥3个独立实验。°P（P）≤ 0.0001; *P（P）≤ 0.05. (B–D类)用富含细胞因子的CGM体外培养NPC的增殖分析。(B类)Th1（白圈）或Th2细胞因子（灰圈）与CGM单独（黑圈）进行比较。注意，Th1条件细胞的增殖率早在n个=扩增2代，而在富含Th2的CGM培养的神经球中没有观察到差异。(C类)Th1细胞因子退出后，NPC在CGM中继续生长n个=6次扩增，与对照NPC（黑圈）相比，之前接触Th1细胞因子的NPC（白圈）生长效率没有差异。(D类)成长NPC的增殖分析在体外富含单个Th1细胞因子的CGM。单用干扰素-γ（白钻石）可显著降低生长速度（从四到六次扩增），而用TNF-α或IL1-β处理的细胞在任何时间点的生长效率均无差异。数据表示为细胞的绝对数量±SEM，总计n个≥3个独立实验*P（P）与对照组相比，≤0.05。(E类)NPC在富含Th1（白色条）或Th2细胞因子（灰色条）的CGM中培养48小时。仅用CGM培养的NPC作为对照（黑条）。注意细胞中显著向G方向移动（33-46%的细胞）0/G公司1以及在暴露于Th1但不暴露于Th2细胞因子时S期细胞的下降。数据表示为门控细胞±SEM的平均百分比，总计n个≥5个独立实验**P（P）与对照组相比，≤0.05。(F类)Ki67的FACS分析。注意G的显著增加0-封闭Ki67——Th1细胞因子调节但不在非调节（Ctrl）或Th2细胞因子调节的NPC中的细胞（灰色条）。黑色条表示Ki67+单元格。数据表示为门控细胞±SEM的平均百分比，总计n个≥10个独立实验。P（P）与对照组相比，≤0.0001。(G公司)与基线值相比，在注射细胞因子3天后，HC或EAE 20 dpi小鼠的SVZ背外侧局部注射IFN-γ/TNF-α后，GF显著降低。细胞因子注射后10天（白条），仅HC的GF仍显著低于正常值。在处死前，通过连续接触全身IddU 10小时来检测NPC的增殖，并仅通过计算IddU进行评估+/伊巴1——（面板中分别为绿色和红色单元格）SVZ中的单元格。黑色条表示基线时间点。数据表示为平均标记指数（L.I.）±SEM，总计n个≥3只小鼠。在这些面板中，显示了注射IFN-γ/TNF-α的两个代表性HC和EAE小鼠的SVZ图像。细胞核用DAPI复染。比例尺：50μm*P（P）≤ 0.05; **P（P）≤ 0.005. LV=侧脑室。
图7
图7
慢性CNS炎症导致神经干细胞静止在体外和体内. (A类)在存在Th1细胞因子（IFN-γ，500 U/ml；TNF-α，200 U/ml，IL-1β100 U/ml）或Th2细胞因子（IL-4、IL-5和IL-13，均为10 ng/ml）的情况下，对主要SVZ NPC进行NCFC分析。在最后48小时（白色条）或整个试验期间（黑色条），SVZ细胞以克隆密度接种在富含细胞因子的NeuroCult中。用Th1或Th2细胞因子处理48小时后，所生成的菌落百分比没有差异，而较长时间（3周）的Th1细胞因子处理导致大菌落生成完全失败。数据表示为菌落/大小占总电镀细胞±SEM的平均百分比，从以下总数中获得n个≥3个独立实验。°P（P）≤ 0.0001; *P（P）≤ 0.05. (B–D类)用富含细胞因子的CGM体外培养NPC的增殖分析。(B类)Th1（白圈）或Th2细胞因子（灰圈）与CGM单独（黑圈）进行比较。注意，Th1条件细胞的增殖率早在n个=扩增2代，而在富含Th2的CGM培养的神经球中没有观察到差异。(C类)Th1细胞因子退出后，NPC在CGM中继续生长n个=6次扩增，与对照NPC（黑圈）相比，之前接触Th1细胞因子的NPC（白圈）生长效率没有差异。(D类)成长NPC的增殖分析在体外富含单个Th1细胞因子的CGM。单用干扰素-γ（白钻石）可显著降低生长速度（从四到六次扩增），而用TNF-α或IL1-β处理的细胞在任何时间点的生长效率均无差异。数据表示为细胞的绝对数量±SEM，总计n个≥3个独立实验*P（P）与对照组相比，≤0.05。(E类)NPC在富含Th1（白色条）或Th2细胞因子（灰色条）的CGM中培养48小时。仅用CGM培养的NPC作为对照（黑条）。注意细胞中显著向G方向移动（33-46%的细胞）0/G公司1以及在暴露于Th1但不暴露于Th2细胞因子时S期细胞的下降。数据表示为门控细胞±SEM的平均百分比，总计n个≥5个独立实验**P（P）与对照组相比，≤0.05。(F类)Ki67的FACS分析。注意G的显著增加0-封闭Ki67——Th1细胞因子调节但不在非调节（Ctrl）或Th2细胞因子调节的NPC中的细胞（灰色条）。黑色条表示Ki67+单元格。数据表示为门控细胞±SEM的平均百分比，总计n个≥10个独立实验。P（P）与对照组相比，≤0.0001。(G公司)与基线值相比，在注射细胞因子3天后，HC或EAE 20 dpi小鼠的SVZ背外侧局部注射IFN-γ/TNF-α后，GF显著降低。细胞因子注射后10天（白条），仅HC的GF仍显著低于正常值。在处死前，通过连续接触全身IddU 10小时来检测NPC的增殖，并仅通过计算IddU进行评估+/伊巴1——（面板中分别为绿色和红色单元格）SVZ中的单元格。黑色条表示基线时间点。数据表示为平均标记指数（L.I.）±SEM，总计n个≥3只小鼠。在这些面板中，显示了注射IFN-γ/TNF-α的两个代表性HC和EAE小鼠的SVZ图像。细胞核用DAPI复染。比例尺：50μm*P（P）≤ 0.05; **P（P）≤ 0.005. LV=侧脑室。
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