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.2008年9月2日；105(35):12849-54.
doi:10.1073/pnas.0803640105。 Epub 2008年8月29日。

基于转录组的细胞外基质蛋白的系统鉴定

Ri-ichiroh Manabe公司 1, Ko Tsutsui公司, 山田富美子, 米娜·木村, 中野义子, Chisei Shimono公司, Noriko Sanzen公司, 古谷裕太, 福田富美彦, 小久靖国, 岛本惠子, Daiji Kiyozumi公司, 佐藤裕雅, 佐藤义雄, Haruki Senoo公司, 山下昭平, 福田喜郎, Jun Kawai先生, 杉浦伸夫, Koji Kimata公司, 吉藏Hayashizaki, 清藤清一（Kiyotoshi Sekiguchi）
附属公司

基于转录组的细胞外基质蛋白的系统鉴定

Ri-ichiroh Manabe公司等。 美国国家科学院程序. .

摘要

细胞外基质（ECM）为所有粘附细胞提供关键支架，调节增殖、分化和凋亡。不同的细胞类型采用定制的ECM，这些ECM被认为在生成有助于细胞特定功能的所谓生态位方面发挥着重要作用。然而，这些定制ECM的分子实体尚未阐明。在这里，我们描述了一种基于计算筛选>60000个全长小鼠cDNA的分泌蛋白，然后进行体外功能分析的ECM蛋白转录全鉴定策略。这些分析筛选了ECM组装活性、与其他ECM分子的相互作用、糖胺聚糖修饰和细胞粘附活性的候选蛋白，然后用免疫组织化学分析进行补充。我们鉴定了16种ECM蛋白，其中7种定位于基底膜（BM）区。通过对这些未知BM蛋白的鉴定，我们可以构建BM蛋白体图，该图代表了BM组织特异性定制的基于免疫组织化学的综合表达谱。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
系统筛选ECM蛋白的方案。有关详细信息，请参阅文本和材料和方法.
图2。
图2。
筛选分析中获得的代表性结果。(A类)使用从头开始GFP标记候选蛋白在293T细胞中的表达以及分化的C2C12成肌细胞或MEF在含有转染293F细胞分泌蛋白的条件培养基中的培养。（比例尺，10μm）(B类)固相结合分析中使用的ECM分子如下：1、I型胶原；2、II型胶原；3、胶原蛋白III；4、IV型胶原；5、V型胶原；6、胶原VI；7、明胶；纤维连接蛋白；9，层粘连蛋白-111；10，层粘连蛋白211/221；11，层粘连蛋白511/521；12、肝素；13，硫酸乙酰肝素；14，硫酸软骨素A；15，硫酸皮肤素；16，硫酸软骨素C；17，硫酸软骨素D；18，硫酸软骨素E；19、透明质酸；和20，BSA（阴性对照）。通过测量GFP荧光强度来确定结合GFP融合蛋白的数量。(C类)通过在转染293F（ECM290）或COS（ECM898）细胞的条件培养基中培养GFP融合蛋白，用肝素酶和肝素酶检测GAG链的附着(小时)，软骨素酶ABC(c)，或仅缓冲区(n个)然后使用抗GFP单克隆抗体进行Western blot分析，以检测候选蛋白的迁移率变化。与GAG降解酶孵育后，涂抹带（星号）消失（或减少），同时出现（或增加）快速迁移带（箭头）。ECM290-GFP融合蛋白的假定蛋白水解片段用箭头表示。(D类)将MG63、HT1080和HeLa细胞培养在含有固定化GFP标记候选蛋白的96个平板中，以检测细胞粘附促进活性。通过Diff-Quick染色观察粘附在底物上的细胞。（比例尺，100μm）(E类)候选蛋白的免疫组织化学定位。用亲和纯化抗体对E16.5小鼠胚胎的矢状面进行染色。以下是具有代表性的本地化数据：ECM201(1)肱骨骨膜；发动机控制模块322(2)脊髓软骨周围的韧带和相关软骨膜；发动机控制模块314(三)肋软骨；ECM306系列(4)，脊髓内的椎间盘；ECM661型(5)，肺上皮；ECM392系列(6)，唇上皮；ECM270系列(7)脉络丛上皮及相关血管；ECM290型(8)，毛囊。ca，软骨；pc，软骨膜；po，骨膜；tl、肌腱或韧带；id，椎间盘；胡，肱骨。（比例尺，100μm）
图3。
图3。
筛选结果摘要。小鼠的登录数、基因组位点、氨基酸数量、PSG和GvH评分，以及由克隆编码的ECM蛋白的结构域结构生物信息学和在体外需要进行筛选分析。在本研究中被赋予新名称的蛋白质被划线（另请参阅表S1). 结果来自在体外筛选和体内右侧还显示了IHC筛查。黄色和灰色标签分别表示阳性和阴性结果。白色标记（空白）表示“未确定”。位于非典型ECM结构的蛋白质为蓝色。软骨（ca）、肌腱/韧带（tl）、软骨膜（pc）和骨膜（po）的间质基质呈阳性染色。*，基于Pfam结构域排列的预测蛋白质结构。FNIII，纤维连接蛋白III型结构域；LG，层粘连蛋白G结构域；VWA，von Willebrand因子A型结构域；VWC，von Willebrand因子C型结构域；KZ，KAZAL型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域；Tg，甲状腺球蛋白1型重复；EF、EF-和钙结合域；TSP1，血小板反应蛋白1型结构域；LRR，富含亮氨酸重复序列；胰岛素样生长因子结合蛋白；Ig，Ig结构域；LRRNT，富含亮氨酸的重复N末端结构域；OLF，嗅觉素样结构域。RGD图案表示为红星.**，结果已经公布（5，6）。
图4。
图4。
发育中磨牙的定制上皮BM。用E16.5小鼠头部额叶切片，免疫组化法测定了38种BM蛋白在下颌第一磨牙钟状期的定位。(A类)BM蛋白的代表性染色模式显示出发育中磨牙不同部位的BM中的独特定位（颊部向左，舌部向右）。箭头表示在单个上皮BMs.oe、口腔上皮中发现的染色强度不对称；oee，外釉质上皮；即内釉质上皮；dl，牙板；cl，颈环；tn，舌；oc，口腔；df，牙囊；dp，牙乳头。（比例尺，100μm）(B类)单个BM蛋白区域表达模式的示意图。磨牙个别上皮细胞层的高、中、不可检测表达水平分别用粗线、细线和虚线表示。星号表示在单个BM中显示不对称定位模式的蛋白质。IEE的三个区域（顶部、中部和底部）被BM蛋白质的差异分布所划分。
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