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.2008年9月；48(3):963-77.
doi:10.1002/hep.22413。

吞噬淋巴细胞后肝星状细胞的活化：一种新的纤维化途径

妮达尔·穆哈娜 1, 萨里特·多隆, 奥里瓦尔德, 阿姆贾德·霍拉尼, 艾哈迈德·艾德, 奥里特·帕波, 斯科特·弗里德曼, 里法特·萨法迪
附属公司

吞噬淋巴细胞后肝星状细胞的激活：一种新的纤维化途径

妮达尔·穆哈娜等。 肝病学. 2008年9月.

摘要

CD8-T淋巴细胞增加和自然杀伤（NK）细胞减少导致肝纤维化。我们已经确定了调节人肝星状细胞（HSC）与体内外特定淋巴细胞亚群相互作用的途径。采用荧光活化细胞分选（FACS）对健康对照组和乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）晚期纤维化患者的外周血淋巴细胞（PBL）和肝内淋巴细胞（IHL）进行了特征分析。用免疫组织化学和共焦显微镜分析肝脏切片。为了研究体外相互作用，来自健康对照组或HCV肝硬化患者的PBL与永生化人HSC系（LX2细胞）或原代HSC共同培养。在IHL中发现了淋巴细胞分布的显著变化，但在PBL中没有发现。HBV/HCV患者的肝脏CD4/CD8比率和NK细胞显著降低。肝硬化患者肝切片中α-平滑肌肌动蛋白的表达以及CD4、CD8和NK细胞的浸润很明显，但在健康对照组中不明显。每个亚群的淋巴细胞主要位于门脉周围区域，靠近HSC，一些直接附着或吞噬。在培养中，HCV衍生CD8亚群刺激HSC活化，但NK细胞减弱HSC活化。共焦显微镜检查发现HSC内的淋巴细胞吞噬作用被阻断细胞内粘附分子1（ICAM-1）和整合素分子或HSC照射完全阻止。Cdc42或Rac1（Rho-guanosine triphosphatase（GTPase）家族成员）的LX2敲低可阻止HCV衍生淋巴细胞的吞噬作用和HSC的激活。

结论：患有晚期人类纤维化的肝脏中CD4/CD8比率和NK细胞显著降低。此外，疾病相关但不健康的淋巴细胞被培养的HSC吞噬，这是由Rac1和Cdc42途径介导的。肝纤维化中HSC吞噬淋巴细胞是调节淋巴细胞在肝纤维化过程中作用的一种新的、潜在的重要途径。

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数字

图1
图1
纤维化患者的淋巴细胞改变。对来自健康供体（黑条）、HCV（开条）和HBV（灰条）纤维化患者的分离肝内和外周血淋巴细胞进行了FACS分析（见患者和方法）。显著差异仅限于肝内淋巴细胞，其中CD4减少，导致CD4/CD8比率增加（图1）；两个纤维化组的NK细胞均减少。
图2
图2
淋巴细胞-肝星状细胞直接粘附现场：肝纤维化HCV患者（B-D）和健康对照组（A）的肝活检用一级抗体染色。用红色Cy-5结合的α-SMA对HSC进行染色，FITC-CD45作为常见的白细胞标记物。共焦激光扫描显微镜用于显示患者和方法中描述的染色切片。HSC（红色箭头）被染色为靠近肝细胞的小红细胞。蓝色/紫色染色的淋巴细胞（白色箭头）仅位于纤维化间隔附近的α-SMA阳性细胞附近，而非其他地方。经典蓝色的FITC-共轭CD45与红色Cy-5α-SMA融合后变成粉红色。
图3
图3
培养中淋巴细胞亚群的促纤维化和抗纤维化作用：LX2细胞与HCV患者或健康对照者的淋巴细胞共培养24小时，无论是混合亚群还是分离亚群。（A） 每组两人的结果。评估蛋白质提取物的α-SMA（上层）作为HSC激活的标记，并与β-actin（第二层）进行比较。上面的面板显示了与混合HCV衍生PBL共同培养后LX2细胞的激活。中间的面板显示HCV CD8细胞，以及在较小程度上的CD4细胞和混合HCV淋巴细胞，激活了HSC，这表现为经western blot评估的α-SMA蛋白的更强烈表达。NK细胞几乎不能激活HSC。图中下部的健康淋巴细胞无法激活HSC。α-SMA（B）表达的mRNA分析结果与蛋白质印迹的结果相对应（上图为LX2，下图为原代分离的HSC）。实验重复了三次，结果几乎相同。此外，尽管这一数字来自两名丙型肝炎病毒携带者和两名健康献血者，但当用其他病例的淋巴细胞重复实验时，结果是可重复的（数据未显示）。FACS使用健康或HCV衍生PBL（C）研究培养淋巴细胞的细胞内细胞因子分析。结果显示，NK细胞的TGF-β减少，IFN-γ分泌增加，CD4和CD8细胞的TGFβ减少，仅CD8亚群的IFN-γ增加。
图4
图4
HSC吞噬淋巴细胞的直接接触终点：LX2细胞与HCV或健康淋巴细胞共培养6小时。与α-SMA结合的Cy-5（红色箭头）将LX2细胞染成红色，与HCV淋巴细胞（白色箭头）直接相邻，用于FITC-结合CD4（A；蓝色）、PE-CD8（B；绿色）以及PE-CD16（NK）HCV衍生细胞（C；绿色）。健康PBL对照组（D）未证明这种相互作用。
图5
图5
使用原代HSC而不是LX2细胞可以看到图4的类似结果。
图6
图6
共培养12、24和72小时后，所有CD45+细胞在HSC（A-B，含LX2细胞；C-D，含原代分离的HSC）内发生吞噬作用，这也分别在每个淋巴细胞亚群中显示（数据未显示）。此外，吞噬作用与摄入淋巴细胞周围的α-SMA阳性包膜有关（绿色箭头，B和D）。这个实验重复了四次以上。
图7
图7
共聚焦显微镜记录吞噬作用：1µm系列切片图像显示，HSC和CD45+细胞在同一共聚焦通道出现和消失，证实了吞噬作用（LX2细胞的选择性切片显示在A-D中，原代分离的HSC的选择性切片显示在G-J中）。HCV衍生的淋巴细胞用DiOC预孵育，清洗，然后与HSC细胞培养。（E–F）LX2细胞和（K和L）初级分离的HSC显示HSC内有淋巴细胞，其DiOC释放到HSC细胞质中。每个淋巴细胞亚群的情况也各不相同（数据未显示）。实验重复了四次。
图8
图8
HSC吞噬后淋巴细胞的凋亡和死亡增加：单独或与HSC（A-B组中的LX2以及C-D组中的原始分离HSC）培养48小时后，通过FACS评估淋巴细胞的凋亡。在吞噬淋巴细胞的情况下，凋亡PBL（A）（定义为CD45+Annexin+和PI（−））显著增加。被定义为CD45+膜联蛋白+和PI（+）的染色淋巴细胞（B）也增加，表明HSC内的淋巴细胞被迅速杀死。
图9
图9
吞噬作用由配体/受体粘附介导。与非人工共培养和非刺激吞噬作用（A）相比，如患者和方法（分别为D和E）所述，在共培养前阻断HSC相关ICAM1和整合素αV，可预防吞噬作用。与淋巴细胞共培养前阻断HSC相关的I类和II类细胞不会影响吞噬作用（分别为B和C）。与淋巴细胞共培养前阻断淋巴细胞相关的T9细胞受体不会影响吞噬作用（F）。只有当照射HSC（H）而非淋巴细胞（G）时，吞噬作用才被阻断。（一） HSC与健康淋巴细胞共同培养时无吞噬作用。
图10
图10
主要HSC显示出与图9中LX2细胞相同的反应。实验重复了四次。
图11
图11
与HCV衍生PBL共培养前ICAM-1或整合素的阻断在功能上伴随着HSC活化的降低：在等β-肌动蛋白存在下，ICAM-1和整合素阻断后，通过western blotting的α-SMA表达谱带降低（下表）。α-SMA mRNA的表达（图10，上面板）与western blot结果一致。
图12
图12
Rac1和Cdc42被招募到吞噬接触区。吞噬作用和细胞间粘附区中的Cdc42和Rac1募集在HSC/HCV衍生的PBL共培养物中得到证实（左侧两张图显示与LX2细胞共培养，右侧两张图显示与原代HSC共培养）。（B和E）FITC-染色的Cdc42和Rac1（分别）为蓝色；（C和F）PE染色的淋巴细胞呈绿色。（A和D）两种染色与LX2细胞的Cy-5红色α-SMA染色重叠（分别）。实验重复了四次以上。
图13
图13
HSC吞噬淋巴细胞需要Rac1和Cdc42。使用特异性siRNA转染实现了Cdc42相关或Rac1相关LX2细胞的沉默。与阴性siRNA对照组相比，特异性siRNA沉默后通过western blotting证实Cdc42下调（下表）。因此，与阴性siRNA对照组相比，通过α-SMA表达评估HSC的激活降低（上表）。Rac1 siRNA沉默的结果与Cdc42效应一致（数据未显示）。这个实验重复了四次。
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