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.2008年8月21日；3（8）：e3034。
doi:10.1371/journal.pone.0003034。

组蛋白H3赖氨酸27特异性脱甲基酶Jmjd3是神经承诺所必需的

托马斯·伯格 1, 法比奥·斯普雷菲科, 弗朗西丝卡·德桑塔, 玛丽亚·格拉齐亚·托塔罗, 埃琳娜·普罗斯佩里尼, 佐阿奇诺·纳托利, 朱塞佩·特斯塔
附属公司

组蛋白H3赖氨酸27特异性脱甲基酶Jmjd3是神经承诺所必需的

托马斯·伯格等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

组蛋白H3赖氨酸4和27的甲基化模式与发育调控的基因激活和抑制状态有关，被认为是建立谱系特异性基因表达程序的基础。最近的研究通过比较ES和神经干（NS）细胞之间染色质和转录的全局变化，以及神经承诺的出发点和到达点，为谱系规范问题提供了基本的见解。有了这些分化状态的图谱，现在的中心任务是解开使这些分化转变成为可能的染色质动力学。特别是，通过多梳介导的H3-K27三甲基化（H3-K27me3）在ES细胞中抑制的谱系特异性基因在分化细胞中被去甲基化和去甲基化的观察表明存在特异性H3-K27去甲基酶。为了深入了解支持谱系规范的表观遗传转化，我们将小鼠ES细胞单层分化为神经干（NS）细胞作为模型系统，研究了神经承诺的早期阶段。从JmjC-结构域基因的综合分析开始，我们在这里报道了最近被鉴定为H3-K27me3特异性去甲基化酶的Jmjd3，它控制着神经发生关键调控因子和标记物的表达，并且是参与神经谱系所必需的。我们的结果证明了一种对抗Polycomb调节的酶活性的相关性，并强调了H3-K27me3的动力学与转录输出相关的不同模式。通过证明H3-K27脱甲基酶Jmjd3是神经谱系的必需酶，并且它能分解Nestin启动子的二价结构域，我们的工作证实了二价结构域分辨率的功能相关性，该功能相关性是基于其控制分辨率和分化之间的全基因组相关性而提出的。此外，我们的数据表明，H3-K27me3的调节具有高度的基因和上下文特异性，这表明甲基转移酶和去甲基化酶的相互作用使微调比甲基化状态的开/关交替更有效。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。含有JmjC-结构域的蛋白质的表达谱确定Jmjd3是一种在神经承诺开始时特异上调的蛋白质。
（a） ES细胞衍生的神经干（NS）细胞构成了一个均匀的神经前体群体。它们显示出神经前体标记物巢蛋白和Sox2的均匀表达，并且对神经元（β-微管蛋白III）或星形胶质细胞（GFAP）抗原几乎没有免疫反应性。（b） ES细胞向NS细胞分化第8天和第26天JmjC基因的表达。mRNA水平通过实时RT-PCR定量。对于每个基因，野生型ES细胞中的转录水平设置为100%。条形代表平均值±S。D.归一化为TBP的三份副本。（c） ES细胞向NS细胞过渡期间Jmjd3的蛋白表达水平。Jmjd3水平在第4天和第8天达到峰值，在已建立的NS细胞培养中下调。从过度表达Jmjd3的细胞中提取的蛋白质用于定位Jmjd 3带（WB-western blot control）。文丘林起到了装载控制作用。
图2
图2。神经承诺需要Jmjd3。
（a） 通过Western Blot评估RNAi敲除ES细胞克隆中Jmjd3的蛋白水平。文丘林起到了装载控制作用。（b） 单层分化第7天，对野生型（w.t.）和Jmjd3敲除（Jmjd 3-kd1和Jmj d3-kd2）细胞的巢蛋白（上面板，第二行）和泛细胞角蛋白（下面板，第二行）以及相控图像（两个面板的第一行）进行免疫染色。在10倍放大的条件下，在野生型和Jmjd3敲除细胞的相同曝光时间下，对16个相邻的正方形进行成像，这些正方形代表了培养皿的覆盖范围。使用ImageJ软件计算平均灰度值。（c） 特写显示了（b）巢蛋白（左面板，第二行）和泛细胞角蛋白（右面板，第二行）的免疫染色以及野生型（w.t.）和Jmjd3敲除（Jmjd 3-kd1和Jmjd3-kd2）的相控图像（两个面板的第一行）中显示的分化培养的示例在单层分化的第7天，野生型和Jmjd3敲除细胞的暴露时间相同。
图3
图3。分化过程中的Jmjd3水平。
（a） 野生型和Jmjd3-kd无性系分化过程中Jmjd_3水平的qRT-PCR分析。条形图表示标准化为TBP的三份样品的平均值±标准偏差。（b） 通过蛋白质印迹分析评估来源于Jmjd3kd的NS细胞和对照ES细胞克隆（w.t.）中Jmjd3蛋白的水平。Vinculin作为负载控制。
图4
图4。Jmjd3调节神经发生的关键效应器。
（a） Jmjd3缺失会损害分化过程中神经元标记物Pax6、Nestin和Sox1的上调。通过实时RT-PCR定量Pax6、Nestin和Sox1的水平。条形图表示标准化为TBP的三份样品的平均值±标准偏差。W.t.：野生型ES细胞；Jmjd3-kd:Jmjd 3敲除细胞。（b） 用染色质免疫沉淀分析基因组区域的方案。Pax6（上面板）、Nestin（中面板）和Sox1（下面板）位点按比例绘制，显示（部分）外显子-内显子结构、转录起始位点、被所谓的二价结构域覆盖的区域（见正文）以及免疫沉淀后qPCR分析的扩增子。（c） 染色质免疫沉淀显示正常ES细胞分化过程中3b中概述的基因组区域的Jmjd3占据水平。浓缩水平以输入染色质的百分比表示。误差条代表qPCR三倍的标准偏差。解开.：未分化ES细胞；第4天和第8天表示区分协议的两个时间点。（d） 染色质免疫沉淀显示正常ES细胞分化过程中3b中概述的基因组区域上H3-K27me3的水平。浓缩水平以输入染色质的百分比表示。条形图是三份独立样本的平均+/-S.E.M。Undiff公司。：未分化ES细胞；第8天：分化方案开始后的时间点；国家安全委员会：神经干细胞（第26天）。（e） 染色质免疫沉淀显示野生型（w.t.）和未分化状态（undiff.）和单层分化第7天的Jmjd3-kd（Jmjd 3-kd1和2）细胞中Nestin启动子上的H3-K27me3水平（见3b）。浓缩水平以输入染色质的百分比表示。条形图是三份独立样本的平均+/-S.E.M。
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