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.2008年8月19日；105(33):11915-20.
doi:10.1073/pnas.0805434105。 Epub 2008年8月11日。

靶向PCSK9的治疗性RNAi可大幅降低啮齿动物的血浆胆固醇和非人灵长类动物的低密度脂蛋白胆固醇

玛丽亚·弗兰克·卡梅涅茨基 1, 阿尔多·格雷夫霍斯特, 诺玛·N·安德森, 蒂莫西·S·拉西, 比吉特·布拉姆拉奇, Akin Akinc公司, 大卫·巴特勒, 克劳斯·查利斯, 罗伯特·多金, 范玉鹏, 克里斯蒂娜·甘巴·维塔洛, 菲利普·哈德维格, 穆萨米·贾亚拉曼, 马提亚斯·约翰, K Narayananair贾亚普拉卡什, 马丁·迈尔, 卢博米尔·内切夫, Kallanthottathil G Rajeev公司, 蒂莫西·里德, 英戈·Röhl, 尤尔根·苏切克, 帕梅拉·谭, 黄蕴瑶, 王刚（Gang Wang）, 特蕾西·齐默尔曼, 安东尼·德福格罗尔斯, 汉斯·佩特·沃恩洛彻, 罗伯特·兰格, 丹尼尔·G·安德森, 穆提亚·马诺哈兰, 维克托·科特利安斯基, 杰·德·霍顿, 凯文·菲茨杰拉德
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靶向PCSK9的治疗性RNAi可大幅降低啮齿动物的血浆胆固醇和非人灵长类动物的低密度脂蛋白胆固醇

玛丽亚·弗兰克·卡梅内茨基等。 美国国家科学院程序. .

摘要

前蛋白转化酶枯草杆菌素/可欣9型（PCSK9）调节低密度脂蛋白受体（LDLR）蛋白水平和功能。PCSK9的缺失会增加肝脏中的低密度脂蛋白胆固醇水平并降低血浆低密度脂蛋白胆固醇（LDLc），而过量的PCSK9活性会降低肝脏低密度脂蛋白胆固醇水平并增加血浆低密度脂蛋白胆固醇。在这里，我们开发了能够靶向小鼠、大鼠、非人灵长类动物（NHP）和人类PCSK9的活性、跨物种、小干扰RNA（siRNA）。在体内研究中，PCSK9和对照siRNAs在脂质纳米粒（LNP）中配制。小鼠和大鼠体内PCSK9的肝特异性siRNA沉默使PCSK9 mRNA水平降低50-70%。PCSK9转录物的减少与血浆胆固醇浓度降低60%有关。这些效应被证明是由RNAi机制介导的，使用5'-RACE。在表达人PCSK9的转基因小鼠中，siRNAs使人PCSK 9转录物沉默>70%，并显著降低PCSK9血浆蛋白水平。在NHP中，单剂量靶向PCSK9的siRNA导致血浆PCSK9、载脂蛋白B和LDLc快速、持久和可逆降低，而对HDL胆固醇（HDLc）或甘油三酯（TGs）无明显影响。单次静脉注射后，PCSK9沉默的效果持续了3周。这些结果验证了以PCSK9为靶点的RNAi疗法作为一种特异性降低LDLc的方法，为开发PCSK9降低剂作为治疗高胆固醇血症的未来策略铺平了道路。

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利益冲突声明

利益冲突声明：R.L.是Alnyam科学咨询委员会的股东和成员。D.G.A.和J.D.H.是Alynylam Pharmaceuticals的顾问。阿尼勒姆还拥有安德森博士、兰格博士及其同事在麻省理工学院发明的某些知识产权的许可证。M.F.-K.、T.S.R.、A.A.、D.B.、K.C.、R.D.、Y.F.、C.G.-V.、M.Jayaraman、K.N.J.、M.Maier、法律公告、K.G.R.、T.R.、J.S.、J.W.、G.W.、T.Z.、A.D.F.、M.Manoharan、V.K.和K.F.是Alnyam Pharmaceuticals的员工。B.B.、P.H.、M.John、I.R.、P.T.和H.-P.V.是罗氏Kulmbach的员工。

数字

图1。
图1。
类脂制剂和PCSK9在野生型小鼠中的沉默作用。(A类)配方的阳离子类脂成分结构。(B类)给药后2天肝脏PCSK9 mRNA的剂量依赖性下降（相对于对照组）(n个=每组6人）。(C类)小鼠肝脏PCSK9 mRNA和血清总胆固醇水平(n个=5/组）5 mg/kg LNP-PCS-A2或PBS剂量后3天(D类)小鼠肝脏PCSK9转录物沉默的持续时间(n个=5 mg/kg或7.5 mg/kg LNP-PCS-A2单次注射后。(B类)学生的单向方差分析吨测试；(C类和D类)采用Bonferroni检验的双向方差分析。(B–D类)每个值为组平均值±STDEV。星号表示PBS和PCSK9 siRNA处理组之间的统计差异。**，P（P）≤ 0.01; ***,P（P）≤ 0.001
图2。
图2。
大鼠肝脏PCSK9沉默、肝脏TGs和LDLR水平。(A类)LNP-PCS-A2介导的剂量依赖性降低给药后3天肝脏PCKS9 mRNA和血清总胆固醇(n个=每组6人）。每个值为组平均值±STDEV。学生的单向方差分析吨测试。星号代表PBS-和PCSK9 siRNA处理组之间的统计学差异*，P（P）≤ 0.05; **,P（P）≤ 0.01. (B类)LNP-PCS-A2治疗大鼠血清总胆固醇的降低(n个=6/组）在给药后2天达到最大值（≈60%），并在≈21天后恢复到基线水平。与PBS和LNP-Crtl组相比，PCSK9治疗组在统计学上具有显著性（直到大约第16天）（单向方差分析，Student’s吨测试，使用P（P）值≤0.05）。(C类)治疗组和对照组动物的肝脏TGs和胆固醇含量（与A类). 肝脏TGs无显著差异（ANOVA：P（P）胆固醇含量方差分析=0.824；P（P）=0.935（LNP-PCS-A2处理的动物与LNP-Crtl-或PBS处理的对照组的TG水平）。(D类)LNP-PCS-A2-、LNP-Crtl-和PBS治疗大鼠肝脏提取物的免疫印迹（与A类). 转铁蛋白受体（TFR）水平用于蛋白质负荷的正常化。（请注意，治疗后的动物通道15是一个明显的异常值，未上调LDLR，仔细检查也未降低PCSK9水平，可能是因为错误注射）。†，相对于PBS。
图3。
图3。
siRNA介导的大鼠PCSK9 mRNA的切割（5′-RACE）。大鼠(n个=4/组），服用4 mg/kg LNP-PCS-A2、LNP-Crtl或PBS，4天后处死。5′-RACE在LNP-PCS-A2-中检测到预测的mRNA裂解产物，而在LNP-Crtl-或PBS-治疗的动物中未检测到预测mRNA裂解产品。圆圈带中87%的克隆映射到预测的siRNA特异性切割位点。
图4。
图4。
PCSK9人源化小鼠中人PCSK9 mRNA沉默和蛋白质减少。(A类)转基因小鼠(n个=4个/组）表达载脂蛋白E启动子下的人PCSK9全长cDNA，用LNP-PCS-A2和LNP-PCS-C2以及LNP-Crtl或PBS进行给药。根据给药后3天的定量PCR测定，LNP-PCCS-C2和LNP-PCS-A2均显著降低人转录物。每个值为组平均值±STDEV。（单向方差分析，学生的吨测试，P（P）PBS-和PCSK9 siRNA-处理组之间≤0.001）。(B类)与对照转基因小鼠相比，经治疗的转基因小鼠的循环人PCSK9蛋白水平降低(n个=每组4个）。每个值代表组平均值±STDEV。与PBS相比，PCSK9 siRNA治疗组的所有时间点具有统计学意义（双向方差分析、Bonferroni检验、，P（P）≤ 0.01).
图5。
图5。
NHP中PCSK9沉默的药理学。(A类)5 mg/kg LNP-PCS-A2治疗的食蟹猴血清LDLc的直接测定(n个=每组5人），LNP-PCS-B2(n个=每组4人），或PBS(n个=每组3人）。(B类)总胆固醇/高密度脂蛋白比值，如A类. (C类)来自治疗组的血浆样本A类用ELISA法分析其PCSK9蛋白水平。LDLc、Tc/HDLc和PCSK9浓度的值以动物体内给药后平均值与给药前平均值的比值绘制。然后将这些值合并为组平均值。(A–C)LNP-Crtl在d4和d7上的表现与PBS相似（数据未显示）。PBS值是各组的平均值±STDEV（第3-14天的平均值）。每个值代表组±STDEV的平均值。采用双向方差分析和Bonferroni检验。星号表示PBS-和PCSK9 siRNA-处理组之间的统计差异。**，P（P）≤ 0.01; ***,P（P）≤ 0.001.
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