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.2008年10月；28(20):6262-77.
doi:10.1128/MCB.00923-08。 Epub 2008年8月11日。

蛋白精氨酸甲基转移酶5抑制白血病和淋巴瘤细胞中肿瘤抑制因子RB家族的转录

李旺 1, 莎米莎·帕尔, 萨伊德·西夫
附属公司

蛋白精氨酸甲基转移酶5抑制白血病和淋巴瘤细胞中肿瘤抑制因子RB家族的转录

李旺等。 摩尔细胞生物学. 2008年10月.

摘要

蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）对染色质进行适当的表观遗传修饰对细胞的正常生长和健康至关重要。人SWI/SNF相关的PRMT5通过直接甲基化H3R8和H4R3参与靶基因的转录抑制。为了进一步了解PRMT5介导的组蛋白甲基化对癌症的影响，我们分析了其在正常和转化的人类B淋巴细胞中的表达。我们的研究结果表明，PRMT5蛋白水平在各种人类淋巴癌细胞中增强，包括转化的慢性淋巴细胞白血病（B-CLL）细胞系。PRMT5过度表达是由PRMT5特异性微RNA 19a、25、32、92、92b和96的表达改变引起的，并导致H3R8和H4R3的全球对称甲基化增加。对PRMT5靶基因如RB1（p105）、RBL1（p107）和RBL2（p130）的表观遗传学标记的评估表明，启动子H3R8和H4R3是高甲基化的，这反过来触发口袋蛋白转录抑制。此外，减少WaC3CD5 B-CLL细胞中PRMT5的表达可消除H3R8和H4R3的高甲基化，恢复RBL2的表达，并抑制癌细胞的增殖。这些结果表明，PRMT5过度表达表观遗传学改变了关键抑癌基因的转录，并表明RBL2启动子处H3R8和H4R3对称甲基化升高在转化的B淋巴细胞病理学中的因果作用。

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数字

图1。
图1。
PRMT5在转化的B细胞系中过度表达。（A） 使用20μg来自正常细胞或指示转化细胞系的核（N）和细胞溶质（C）提取物对PRMT5和人类SWI/SNF亚单位进行Western blot分析。测量α-微管蛋白的表达，以区分N和C组分。（B） 免疫荧光用于测量PRMT5、H3（Me2)R8和H4（Me2)正常和转化的B-CLL细胞中的R3。用荧光素异硫氰酸标记的羊抗兔抗体检测PRMT5和修饰组蛋白，DAPI染色细胞核。照片是在100倍放大率下拍摄的。PI，免疫前抗体。（C） 当评估H3R8的对称甲基化时，使用从正常或转化B细胞中分离的2μg总组蛋白进行Western blot分析。当抗H4（Me2)R3用于监测H4R3的甲基化，在凝胶上加载7.5μg总组蛋白。Ponceau S染色显示，所有四个核心组蛋白都平等地转移到硝酸纤维素膜上。
图2。
图2。
在转化的淋巴细胞中，PRMT5的表达在翻译水平上增强。（A） 为了测量PRMT5项目在正常和转化的B细胞中，使用总RNA进行三次实时RT-PCR，共三次。GAPDH公司mRNA水平作为内部对照。（B） 为了验证PRMT家族的其他成员也受到转录抑制，我们通过实时RT-PCR测量了PRMT6的水平，如A组所述。在254 nm（OD）处测定每个组分的光密度254)，并显示40S、60S和80S mRNA和多核糖体的位置（上面板）。下部面板显示PRMT5项目mRNA存在于每个组分中，通过实时RT-PCR使用从每个梯度组分沉淀的总RNA进行测量。β-肌动蛋白mRNA被用作内部对照以正常化PRMT5项目每个组分的mRNA水平。每个图中的数据点表示三份RT-PCR±标准偏差的平均值。
图3。
图3。
PRMT5特异性miRNA在正常和转化的B细胞中表达不同，它们的再表达可以抑制PRMT5的翻译。（A） 使用miR-19a、miR-19b、miR-25、miR-32、miR-92、miR-92b和miR-96探针对从指示细胞中分离的10μg总RNA进行RPA。使用ImageQuant v5.0从三个独立实验中对成熟和受保护的miRNA条带进行量化，并绘制条形图。（B） 用2.5或5.0μg指示的野生型（WT）和突变型（MUT）dsRNA对WaC3CD5和Mec1细胞系进行电穿孔，并使用抗PRMT5抗体对20μg全细胞提取物进行Western blotting分析。为了证明样品的负载是相等的，测量了每个样品中的β-肌动蛋白水平。为了证明每个miRNA的特异性，显示了miR-197，它与PRMT5 3′UTR没有任何序列互补性。
图4。
图4。
PRMT5被招募到肿瘤抑制基因的RB家族并表观遗传修饰。使用免疫前（PI）或免疫抗-PRMT5（A、C和E）抗体或免疫抗-H3（Me2)R8或抗H4（Me2)R3抗体（B、D和F）。用实时PCR扩增免疫纯化DNARB1型-,RBL1型-，或RBL2型-特定的引物组和探针。（G和H）为了证明PRMT5在RB抑癌基因家族中的招募是特异性的，我们检测了PRMT5与ST5型计算每个抗体相对于PI样品的富集变化，每个ChIP实验重复两次，一式三次。
图5：。
图5：。
正常和转化B细胞中口袋蛋白的表达。（A） 通过实时RT-PCR检测正常和转化的B细胞中肿瘤抑制因子RB家族的mRNA表达。图中显示了每个基因相对于正常B细胞表达的标准化变化GAPDH公司作为内部控制。（B） 从正常和转化的B细胞制备全细胞提取物，并使用指示的抗体通过Western blotting分析25μg总蛋白。使用抗β-肌动蛋白来表明装载了等量的蛋白质。（C）RBL1型-和RB1型-特异性miRNAs在正常和转化的B细胞中表达不同。使用探针对从指示细胞中分离的10μg总RNA进行RPA，以检测RBL1特异性miRNAs、miR-22和miR-452，以及RB1-特异性miRNA、miR-649和miR-520。作为对照，miR-646的水平在正常和转化的B细胞中没有波动。探针单独代表每个反应混合物中使用的标记探针总量的1/10，对照（Ctrl）显示在酵母tRNA存在下探针的消化。箭头表示成熟和受保护的miRNA的位置。（D） 使用ImageQuant v5.0对面板C中显示的成熟和受保护的miRNA条带进行定量，并将两个独立实验的数据绘制为条形图。
图6。
图6。
在增殖的正常B细胞中，RBL2 mRNA和蛋白水平没有波动。（A） 为了监测正常B细胞的活化和增殖，用重组人IL-4和山羊抗人IgG+IgM治疗0、2和4天后，测定BrdU阳性细胞的分数。BrdU掺入的百分比通过BrdU阳性细胞的数量除以计数的细胞总数来计算。（B） 在IL-4和抗人IgG+IgM治疗4天后，从静止（R）或活化（A）B细胞中收集全细胞提取物，并使用指示的抗体通过Western blotting分析25μg总蛋白。包括抗β-肌动蛋白，以显示相等的负荷。（C） 如图5A的图例所示，通过实时RT-PCR两次三次分析肿瘤抑制基因RB家族的mRNA水平。
图7。
图7。
减少PRMT5的表达会损害癌细胞的生长。（A） 为了减少PRMT5蛋白的表达，将转化的WaC3CD5 B-CLL细胞系感染含有单独载体或含有AS-PRMT5 DNA载体的重组慢病毒。在0、2和4天后，使用抗PRMT5和抗β-肌动蛋白抗体通过Western blotting分析25μg全细胞提取物。（B） 每隔2天分析一次PRMT5敲除细胞系和对照细胞系的生长速度，持续6天。所示为三个独立实验的平均值。（C） 稳态水平RBL2型在0、2和4天后，使用来自对照和AS-PRMT5细胞的总RNA通过实时RT-PCR分析mRNA。（D） 从对照和AS-PRMT5细胞中收集全细胞提取物（25μg），并用抗PRMT5、抗RBL1、抗RB1、抗RBL2和抗β-肌动蛋白抗体进行Western印迹。
图8。
图8。
siRNA-介导的PRMT5基因敲除导致RBL2去表达和转化的B细胞生长缓慢。（A） 用对照（Ctrl）siRNA、siPRMT5或siPRMT5+siRBL2处理转化的WaC3CD5 B-CLL细胞，并在指定时间用Western blotting法分析25μg全细胞提取物，使用抗PRMT5、抗RBL2、抗RB1和抗RBL2-抗体。抗β-肌动蛋白作为对照。（B） 通过计算0、2和4天的活细胞数，用Ctrl-siRNA、siPRMT5或siPRMT5+siRBL2电穿孔转化的WaC3CD5 B-CLL细胞的生长速度。每个数据点代表三个独立实验的平均值。（C） 实时RT-PCR用于测量E2F1系列，RR2号机组、和β-肌动蛋白使用来自WaC3CD5细胞的总RNA与Ctrl-siRNA、siPRMT5或siPRMT5-和siRBL2电穿孔，如图5A图例所示。
图9：。
图9：。
siRNA-介导的PRMT5敲除消除基因特异性和全局H3R8和H4R3对称甲基化。（A） ChIP分析用于评估PRMT5与RBL2型启动子和用控制（Ctrl）siRNA或siPRMT5电穿孔的WaC3CD5细胞中H3R8和H4R3甲基化水平。（B） 为了观察PRMT5敲除对组蛋白H3R8和H4R3的整体对称甲基化的影响，按照图1B的图例进行免疫荧光染色。用Ctrl-siRNA或siPRMT5电穿孔WaC3CD5细胞，4天后用免疫前（PI）、抗-PRMT5、抗-H3（Me2)R8或抗H4（Me2)R3抗体。照片是在100倍放大率下拍摄的。
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