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.2008年8月8日；31(3):347-59.
doi:10.1016/j.molcel.2008.05.023。

介体将神经元基因表达的表观遗传沉默与x连锁精神发育迟滞联系起来

宁鼎 1, 周海英（Haiying Zhou）, 皮埃尔·奥利维尔·埃斯特夫, Hang Gyeong Chin（Hang Gyeong Chin）, Seokjoong Kim先生, 徐宣, Sumy M Joseph先生, 迈克尔·J·弗里兹, 查尔斯·施瓦茨, 斯里哈萨·普拉丹, 托马斯·博伊尔
附属公司

介体将神经元基因表达的表观遗传沉默与x连锁精神发育迟滞联系起来

宁鼎等。 分子电池. .

摘要

介体在RNA聚合酶II转录中起着核心作用，是汇聚在蛋白质编码基因启动子上的调节信号的传感器、整合器和处理器。与介体在基因激活中的作用相比，关于介体作为抑制信号的传递者的分子机制和生物学意义，人们知之甚少。在这里，我们描述了神经元外基因沉默所需的蛋白质相互作用网络，包括介体、G9a组蛋白甲基转移酶和RE1沉默转录因子（REST；也称为神经元限制性沉默因子，NRSF）。我们发现，介体中的MED12界面将REST与G9a-依赖组蛋白H3K9二甲基化连接起来，以抑制非神经元细胞中的神经元基因。值得注意的是，MED12中的错义突变导致X连锁精神发育迟滞（XLMR）障碍FG综合征和Lujan综合征破坏了其REST辅升压功能。这些发现暗示了神经系统神经元基因表达的表观遗传限制中的介体，并提示MED12相关的XLMR涉及REST依赖性神经元基因调节受损的病理基础。

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数字

图1
图1。MED12和G9a在体内外相互作用
（A） MED12和G9a上相互结合结构域的示意图摘要。MED12（aa 1616–2050）上富含脯氨酸、谷氨酰胺和亮氨酸（PQL）的结构域与G9a上富含半胱氨酸的结构域（aa 250–332）相比，与Ankyrin重复结构域（aa 486–689）的相互作用更强。（B） 如图所示，在使用针对FLAG或HA表位的特异性抗体进行全细胞裂解物免疫沉淀（IP）之前，FLAG-MED12和HA-G9a在HeLa细胞中相互表达或不表达。免疫沉淀物通过SDS-PAGE溶解，并使用所示的FLAG或HA特异性抗体通过western blot（WB）分析处理。输入10%的核裂解物用于IP反应。
图2
图2。MED12是G9a HMTase可能的中介接口
（A） 如图所示，使用针对MED30的IgG或抗体对HeLa核裂解物进行IP处理。免疫沉淀物用300 mM KCl和0.2%NP-40清洗，然后用SDS-PAGE进行分离，并用指定抗体进行WB分析处理。输入10%的核裂解物用于IP反应。（B） 在COS-7细胞中短暂表达DsRed-G9a和FLAG-Mediator亚单位后，监测它们的共定位。用Hoechst染色法观察DNA。（C和D）HeLa核裂解物经IgG或G9a、MED4或MED30特异性抗体IP处理。免疫沉淀物在与S公司-腺苷-L-[甲基-三H] 蛋氨酸和核心组蛋白（C）或一组重组GST-H3 N末端（aa 1–84）携带指示的赖氨酸到精氨酸替代突变（D）。反应产物通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影术、WB或考马斯蓝染色进行可视化，如图所示。H3me，甲基化H3。（E和F）转染对照（CNTL）、G9a-、MED12-、MED23-或CDK8-特异性siRNAs的HeLa细胞的核裂解物使用IgG或MED30或MED4特异性抗体进行IP，如图所示。在通过SDS-PAGE进行分离之前，按照（A）中的方法清洗免疫沉淀物，并使用指定抗体通过WB分析进行处理，或与S公司-腺苷-L-[甲基-三H] 蛋氨酸和核心组蛋白（HMTase分析）。输入10%用于IP反应的核裂解物。H3me，甲基化H3。
图3
图3。MED12是REST和G9a依赖性神经元基因抑制所必需的
（A） 未转染（−）或转染（+）Myc-tagged REST的HEK293细胞核裂解物中MED30特异性介体免疫沉淀物通过SDS-PAGE进行解析，并使用指定抗体通过WB分析进行处理。输入5%用于IP反应的核裂解物。（B） 携带G9a的MED30特异性介体免疫沉淀物（来自图2A和补充图S6）用REST特异性抗体重新绘制。（C）用SDS-PAGE溶解MED31/HeLa核裂解液中连续几轮IP产生的末端免疫沉淀物，随后产生G9a特异性抗体，并用指定抗体进行WB分析。输入，第一轮IP反应中使用的核裂解液的5%。（D） 使用双荧光素酶分析系统，对连续转染对照、REST-、G9a-、MED12-、CDK8-或MED23-特异性siRNA的BG1细胞的全细胞裂解物以及随后转染TATA-Luc或RE1-TATA-Lug报告质粒的细胞裂解物进行标准化荧光素酶活性分析。荧光素酶活性的表达与转染TATA-Luc报告质粒的细胞中获得的荧光素酶活性有关，该报告质粒的值被任意指定为1。数据表示至少三个重复进行的独立实验的平均+/-SEM。星号表示相对于对照siRNA的统计学显著值（Student’st吨测试*P（P）< 0.1, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.01). （E） 转染对照、REST-、MED12-、G9a-、MED23-或CDK8-特异性siRNA的HeLa细胞RNA用于RT-qPCR。mRNA水平相对于对照siRNA转染细胞中的mRNA水平进行表达，该值被任意指定为1。数据表示至少三个重复进行的独立实验的平均+/-SEM。星号表示相对于对照siRNA的统计显著值（学生t吨测试*P（P）< 0.1, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.01). （F） 分析细胞的核裂解物(D类)通过SDS-PAGE进行解析，并使用所示抗体进行WB分析，以验证击倒效率。
图4
图4。RE1沉默元素的REST定向G9a招募需要MED12
（A–D）从未转染的HeLa细胞（A和B）或用对照、REST-、MED12-、G9a-、MED23-或CDK8特异性siRNA转染的HeLa细胞制备的可溶性染色质，如所示（C和D），使用所示抗体[IgG:山羊（g）和兔（r）IgGs]进行一轮（A、C和D）或两轮（B）IP。免疫沉淀染色质通过半定量（A和B）或定量（C和D）PCR分析，使用侧翼RE1元件的引物或M4、SNAP25和Synapsin1基因内的上游基因序列。在（C和D）中，每个蛋白质的RE1位点占用水平相对于其在对照siRNA-转染细胞中的占用水平进行表达，该值被任意指定为100%。数据表示至少三个独立实验（一式三份）的平均+/-SEM。星号表示相对于对照siRNA的统计显著值（学生t吨测试*P（P）< 0.1, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.01).
图5
图5。REST、Mediator和G9a之间的直接成对交互
（A） 表达为GST融合蛋白的REST片段图。数字是指氨基酸坐标。NTRD、CTRD、8 X锌指、K和Pro分别指N-和C-末端阻遏结构域、锌指DNA-结合结构域和赖氨酸或脯氨酸富集结构域。（B） 用于体外结合分析的纯化大肠杆菌表达的GST-REST、HeLa细胞介体（MED）和杆状病毒表达的G9a蛋白制剂。从稳定表达HA表位标记的MED6亚单位的HeLa细胞中纯化介体（Kim等人，2006年）。（C和D）将所示的固定化GST或GST-REST衍生物与纯化的介体（C）或G9a（D）孵育，并在使用指定抗体进行WB分析之前通过SDS-PAGE解析特异性结合的蛋白质。输入，10%的介体或G9a用于结合反应。（E） 纯化介体和G9a在IP之前与MED6上G9a或HA表位的特异性抗体一起或不一起培养。免疫沉淀物通过SDS-PAGE溶解，并使用指定抗体通过WB分析进行处理。
图6
图6。REST中MED12/介体和G9a-依赖性内抑制域的描述
（A） 在使用指定抗体进行WB分析之前，将所示固定化GST或GST-REST衍生物与HeLa核裂解物和通过SDS-PAGE解析的特异结合蛋白孵育。输入10%的核裂解物用于结合反应。（B） 通过SDS-PAGE解析来自（C）中的代表性瞬时抑制测定的全细胞裂解物，并通过WB分析处理，使用对Gal4 DNA结合结构域或TFIIH的p89亚基特异的抗体作为内部负载对照。箭头表示Gal4-REST导数的相对位置，它们以大致相等的水平表示。（C） HeLa细胞与G基因共转染5TK-Luc报告子在TK启动子上游携带五个Gal4-DNA-结合位点以及Gal4-DNA结合域（Gal4）或指示的Gal4-REST片段。使用双荧光素酶分析系统对转基因全细胞裂解物进行标准化荧光素酶活性分析。荧光素酶活性（RLU）的表达与转染Gal4的细胞中获得的荧光素酶活性有关，该细胞的荧光酶活性被任意指定为1。数据表示至少三次重复进行的独立转染的平均+/-SEM。星号表示与Gal4（学生的t吨测试*P（P）< 0.1, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.01). （D） HeLa细胞在与pG共转染48小时前转染对照、MED12-或G9a-特异性siRNA5TK-Luc和Gal4或指示的Gal4-REST片段，以及随后对转染的全细胞裂解物进行标准化荧光素酶活性的分析。荧光素酶活性的表达与转染对照siRNA和Gal4的细胞中获得的荧光素酶活性有关。数据表示至少三次重复进行的独立转染的平均+/-SEM。星号表示统计学上的显著差异（学生t吨测试*P（P）< 0.1, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.01). （E） pG共转染HeLa细胞5在检测转染的全细胞裂解物的标准化荧光素酶活性之前，用DMSO或HDAC抑制剂TSA（330 nM）处理TK-Luc和Gal4或指示的Gal4-REST片段。荧光素酶活性的表达与转染Gal4的DMSO处理细胞中获得的荧光素酶活性有关。数据表示至少三次重复进行的独立转染的平均+/-SEM。星号表示具有统计学意义的差异（学生t吨测试*P（P）< 0.1, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.01).
图7
图7。MED12中与XLMR相关的错义突变破坏其REST特异性协同表达功能
（A和B）HeLa细胞转染对照（CNTL）或MED12特异性siRNA，随后转染内部对照SV40-β-半乳糖苷酶表达质粒和pG5TK-Luc和Gal4、Gal4-REST 141–600（A）或Gal4-β-catenin（B）。如有指示（MED12r），DNA转染还包括siRNA-resistant WT、FG、Lujan或ΔPQL突变MED12衍生物。正常化的荧光素酶活性相对于转染对照siRNA和Gal4的细胞中获得的荧光素酶活性进行表达，该值被任意指定为1。在（B）中，将对照siRNA转染的细胞中β-连环蛋白的相对萤光素酶活性设置为100%，产生相对反式激活水平（RTL）；MED12 siRNA-转染细胞中相应的反式激活水平与该值相关。数据表示至少三次重复进行的独立转染的平均+/−SEM。星号表示与MED12r WT（学生的t吨测试*P（P）< 0.1, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.01). （C） 使用SDS-PAGE解析（A）中代表性瞬时击倒/拯救试验的全细胞裂解物，并使用MED12、MED12r衍生物上的FLAG表位或TFIIH的p89亚单位特异性抗体进行WB分析。用对照（siCNTL）或MED12-特异（siMED12）siRNA转染（D–F）HeLa细胞。如有指示（MED12r），用siRNA-resistant WT、FG或Lujan突变型MED12表达质粒转染MED12敲除细胞。（D） 用Synapsin1-和M4特异性引物对转染细胞的RNA进行RT-qPCR。mRNA水平相对于对照siRNA转染细胞中的mRNA水平进行表达，该值被任意指定为1。（E和F）使用指示的抗体对来自转染细胞的可溶性染色质进行IP处理。使用突触蛋白1和M4基因内RE1元件侧翼的引物，通过qPCR分析免疫沉淀染色质。每个蛋白质的RE1位点占用水平相对于其在对照siRNA-转染细胞中的占用水平进行表达，该值被任意指定为100%。数据表示至少三个重复进行的独立实验的平均+/-SEM。星号表示与MED12r WT（学生的t吨测试*P（P）< 0.1, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.01).
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