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.2008年10月10日；283(41):27628-27635.
doi:10.1074/jbc。M805711200。 Epub 2008年8月7日。

SIRT1对乙酰化状态、细胞溶质定位和LKB1活性的调节。AMP活化蛋白激酶激活的可能作用

范澜 1, 何塞·M·卡奇塞多 2, 尼尔·鲁德曼 1, Yasuo Ido先生 三
附属公司

SIRT1对乙酰化状态、细胞溶质定位和LKB1活性的调节。AMP活化蛋白激酶激活的可能作用

范澜等。 生物化学杂志. .

摘要

组蛋白/蛋白质脱乙酰酶SIRT1和AMP活化蛋白激酶（AMPK）是负责长寿和能量平衡的关键酶。我们研究了这些涉及主要AMPK激酶LKB1的分子之间是否存在机械联系。初步研究表明，LKB1在培养的（HEK293T）细胞、小鼠白色脂肪组织和大鼠肝脏中乙酰化。在293T细胞中，SIRT1过表达减少了LKB1的赖氨酸乙酰化，同时增加了其活性、细胞质/核比率以及与LKB1激活物STRAD的关联。相比之下，研究中SIRT1的短发夹RNA对这些参数有相反的影响。质谱分析确定LKB1的乙酰化发生在多个但特定的赖氨酸残基上；然而，只有赖氨酸48突变为精氨酸（模拟脱乙酰化），才能再现激活的SIRT1的所有效应。SIRT1还影响了LKB1的下游目标。因此，它的过度表达增加了AMPK和乙酰-CoA羧化酶磷酸化，相反，RNA干扰介导的SIRT1敲除降低了AMPK磷酸化和另一个LKB1靶MARK1的磷酸化。与培养细胞的结果一致，与饥饿对照大鼠相比，饥饿48小时大鼠肝脏中LKB1赖氨酸乙酰化总量减少了60%，这与LKB1和AMPK活性适度但显著增加有关。这些结果表明，LKB1脱乙酰化受SIRT1调节，这反过来影响其细胞内定位、与STRAD的关联、激酶活性和激活AMPK的能力。

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数字

图1。
图1。
LKB1乙酰化和SIRT1的影响。 A、，赖氨酸外源表达的LKB1的乙酰化。Myc-tagged LKB1表达于HEK293T细胞免疫沉淀(N个)和共价链接的(C类)抗Myc抗体蛋白A珠。B、，调制在293T细胞中通过SIRT1进行LKB1乙酰化。表达GST-LKB1的质粒与pcDNA或shRNA慢病毒一起转染HEK293T细胞对照、SIRT1 WT或H355Y质粒（0.5μg）或SIRT1慢病毒的shRNA。此外，用50–100μ米白藜芦醇0.5–1小时。收集细胞进行Western blotting量化LKB1乙酰化。*,第页<0.05与控件。样品数量如所示圆括号。C、，SIRT1对GST-LKB1的直接脱乙酰作用在体外.净化GST-LKB1在含有1μl含/不含0.6 m的重组SIRT1溶液米北美+在30°C持续30分钟(n个= 6).D、，SIRT1表达水平影响STRAD与LKB1的关联。将SIRT1转染293T细胞质粒或shRNA沉默信息调节因子1STRAD与LKB1的结合通过计算STRAD与LKB1的比率，并用比率的百分比表示在控制单元中(*,第页< 0.05与C相比.编号样品中有个括号).E类和F、，的影响SIRT1过表达对LKB1活性的影响(E类)和磷酸化(F类).E、，将0.2μgSIRT1质粒。在LKB1-免疫沉淀样品中评估LKB1活性(*,第页< 0.005与对照（pcDNA）质粒，n个= 3). H355Y突变体没有增加LKB1活性。F、，将0.2μg的SIRT1和0.5μg的GSTl-LKB1质粒，并用指示的抗体进行印迹。
图2。
图2。
LKB1脱乙酰化调节的关键赖氨酸的鉴定。 A、，LC-MS/MS和MALDI-TOF分析表明LKB1被乙酰化在其三个结构域中的每一个中的许多赖氨酸残基上。这个星号指出乙酰化赖氨酸的位置。这个分析重复六次，乙酰化修饰的结果（详见补充图S2）。B、，识别LKB1上与内源性SIRT1相互作用的结构域。表达LKB1和SIRT1的GST标记片段的质粒共转染到HEK293T细胞中。GST-LKB1片段用GSH珠，并用GST和SIRT1抗体进行印迹。强大的关联是在LKB1和SIRT1。C、，赖氨酸到精氨酸的点突变效应在44至97个地点。N-末端赖氨酸残基为系统地突变为脱乙酰化模拟精氨酸并在HEK293T细胞。只有Lys-48显示Ser-428和苏尔-336(n个= 4).D类和E、，精氨酸的作用SIRT1诱导的AMPK、LKB1磷酸化的Lys-48点突变Thr-336和LKB1活性。SIRT1过度表达（2μg）显著增加野生型Thr-336的磷酸化(重量)LKB1。相反，Thr-336的磷酸化基本上增加，但对SIRT1不敏感K48R突变体过度表达。在AMPK中观察到类似的趋势磷酸化。在KD表达细胞中未观察到任何变化。数字指与对照细胞相比，带密度的折叠变化(D类).E、，293T细胞表达GST-K48R LKB1的活性比野生型高2倍(*,第页< 0.05,n个= 4).F、，SIRT1过度表达对细胞的影响K48R LKB1的分布。表达GFP标记的LKB1的质粒携带将显示的突变转染到HEK293T细胞中，有或没有SIRT1。SIRT1过度表达增加了WT LKB1的胞浆/核比率，但在K48Q LKB1突变体中没有这样做。当使用K48R时，细胞溶质LKB1的分布已经增加(*,第页< 0.05与WT LKB1未感染SIRT1，n个= 15–20),SIRT1过度表达并没有进一步增加。
图3。
图3。
A、，SIRT1过度表达对AMPK和ACC的影响磷酸化。在6孔板中生长的细胞转染2μg野生型SIRT1或无活性SIRT1 H355Y突变体。比率SIRT1过表达增加磷酸化/总AMPK和ACC，而SIRT1 H355Y没有影响(*,第页< 0.05与pcDNA，n个= 3). AMPK也有类似增加在其他实验中观察到磷酸化。B、，的影响SIRT1对HEK293T细胞AMPK和ACC磷酸化的抑制作用。转染SIRT1靶向siRNA的HEK293T细胞中磷酸化/AMPK和ACC总量(*,第页< 0.05与siRNA控制，n个= 6).C、，SIRT1的影响HepG2细胞中MARK1磷酸化的敲除。慢病毒感染shRNA靶向沉默信息调节因子1在HepG2细胞中磷酸化为总MARK1的69%(*,第页<0.05,n个= 6).
图4。
图4。
A–C，饥饿对肝脏LKB1活性的影响(A类)，乙酰化(B类)和AMPK磷酸化(C类).Sprague-Dawley大鼠挨饿48小时或挨饿，然后参照标准吃24小时(联邦调查局人员). 在戊巴比妥麻醉下，肝脏取出并冷冻，以进行指示的测量。48小时后饥饿、LKB1活性和AMPK磷酸化较高LKB1乙酰化水平低于饥饿再喂养大鼠(*,第页< 0.05与联邦调查局人员，n个= 6).
图5。
图5。
提出了SIRT1激活LKB1的机制。激活LKB1和LKB1靶分子通过SIRT1，提出了作用机制。激活的因素SIRT1导致一个或多个关键赖氨酸残基在LKB1。这反过来增强了LKB1与STRAD和MO25的结合，从而增加其激酶活性，并导致AMPK的磷酸化和活化，MARK1，以及可能的其他LKB1目标。该方案假设LKB1SIRT1的乙酰化作用发生在细胞核中，这有助于LKB1通过与STRAD结合向细胞质移动。未显示STRAD激活LKB1还导致LKB1在Ser-428和Thr-336（见正文）。(*=活性酶。）
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