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。2008年8月15日；181(4):2855-68.
doi:10.4049/jimmunol.181.4.2855。

CD28协同刺激对人类T调节的扩展和功能至关重要

塔蒂亚娜·戈洛维纳 1, 塔蒂亚娜·米赫埃娃, 梅根·M·苏霍斯基, 妮可·阿基, 维多利亚C台, 小川山, 刘荣华, 罗伯特·巴尔卡塞尔, 南希·费希尔, 布鲁斯·莱文, 理查德·卡罗尔, 诺埃尔·华纳, 布鲁斯·R·布拉泽, 卡尔·H·琼, 詹姆斯·莱利
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CD28协同刺激对人类T调节的扩展和功能至关重要

塔蒂亚娜·戈洛维纳等。 免疫学杂志。 。

摘要

外周血T调节细胞（Tregs）所需的共刺激要求尚不清楚。使用基于细胞的人工APC，我们发现CD28而非ICOS、OX40、4-1BB、CD27或CD40配体共刺激维持了高水平Foxp3表达和体外抑制功能。只有在雷帕霉素存在下的CD28共刺激持续产生Tregs，持续抑制免疫缺陷小鼠的异种移植物抗宿主病。在雷帕霉素存在下用CD28共刺激培养8-12天后对Tregs进行再刺激，结果在不到3周的时间内Tregs扩增了1000倍以上。接下来，我们确定其他共刺激途径是否可以增强CD28共刺激Tregs的复制潜力。我们观察到，虽然OX40共刺激增强了CD28共刺激Tregs的增殖能力，但Foxp3的表达和抑制功能减弱。这些研究表明，扩张Tregs的共刺激需求不同于T效应细胞的共刺激要求，此外，他们扩展了小鼠Tregs研究结果，以证明人类胸腺后Tregs需要CD28共刺激来在体内扩张和维持强大的抑制功能。

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数字

图1
图1。CD28共刺激需要持续获得Foxp3表达丰富的扩增培养物
A。CD127缺失和CD25选择CD4 T细胞后，分析纯化CD4 T淋巴细胞（左面板）、CD25（中面板）和Foxp3（右面板）中CD25的表达。该数据代表了本研究中使用的所有输入Treg种群的丰富程度。B。流式细胞术分析CD64和CD86在K64（左面板）和K64.86（右面板）aAPCs上的表达。C、。用携带抗CD3抗体的K32 aAPCs和在有无雷帕霉素（RAPA）的条件下培养的携带抗CD3-抗体的K32.86 aAPC刺激200000个富集的Tregs两周，并通过细胞计数测量种群倍增率。每个数据点代表四个独立实验的平均值（误差条代表标准偏差）。D和EFoxp3分析(D类)或CD27和CD62-L（双正极）(E类)在雷帕霉素存在下，Tregs的表达随着载抗CD3抗体的K32或K32.86 aAPCs的增加而增加。左边的面板显示了一个有代表性的实验，右边的方框图是从4个独立实验中汇编的数据。
图2
图2。基于细胞的aAPC上的CD28配体比基于珠的aAPCs更有效地扩张Tregs
A。2×105用CD3/28抗体包被珠或抗CD3负载的K64.86 aAPCs刺激富集的Tregs，并在有或无雷帕霉素的条件下培养两周。按照材料和方法中的描述测量膨胀。B。使用从四位捐赠者收集的数据绘制的方框图，显示了每种培养条件下的折叠扩展。通过将培养结束时的细胞总数除以在有或无雷帕霉素的情况下显示的aAPC刺激的初始起始数来确定折叠扩张。C、。用CD3/28抗体包被珠（BD）或抗CD3负载的K64.86 aAPCs扩增Tregs中Foxp3和CD25表达的分析。数据代表了四个独立的实验。
图3
图3。CD27、4-1BB、CD40L、OX40或ICOS共刺激不能替代CD28共刺激促进Treg扩张
A。2×105用基于细胞的aAPC刺激富集的Tregs，该aAPC传递指示的共刺激信号，并培养雷帕霉素的存在。通过细胞计数来测量种群倍增率。每个数据点代表三个独立实验的平均值（误差条代表标准偏差）。B和C年扩大的细胞群分析A。Foxp3培养14天后(B类)CD62-L和CD27(C类)表达式。
图4
图4。一致抑制在体外雷帕霉素存在下用CD28协同刺激Tregs扩增
A。使用指定的基于细胞的aAPC扩增Tregs。在抑制试验中，用CFSE标记自体PBMC，并使用抗CD3抗体包衣珠刺激，并与无Tregs（顶面板）或膨胀Tregs以1:4的比例混合（Treg:PBMC）。直方图显示CD8+细胞的扩张。折叠展开和百分比抑制（括号）显示在左上角。B和C。散点图显示CD28共刺激Tregs在添加和不添加雷帕霉素的情况下的扩张程度(B类)或通过抗CD3抗体或抗CD3和CD28共刺激Tregs在雷帕霉素中扩张(C类)抑制CD8+T细胞增殖。每个点代表一种单独的文化；平均（+/−s.d）抑制活性被指示。进行配对T检验以确定各组间差异的显著性。
图5
图5。CD28和雷帕霉素扩张的T调节蛋白对异种GVHD的体内预防作用
A。2×10的起始细胞群（SCP）5在存在或不存在雷帕霉素的情况下，用K64.86 aAPC刺激CD4体积T细胞（CD4）或富集的Tregs（CD25+）。培养两周后，用流式细胞仪检测Foxp3（filled）的表达和同种对照抗体（open）染色。B。 体外抑制中描述的每个种群A类如图4所示进行测量。数据代表四个独立的实验。C、。A中显示的每种培养物中有200万个细胞与1000万个自体PBMC混合，并注入NOG小鼠（每组6只小鼠）。8周后，给小鼠放血，并测定人CD8+T细胞/μl血液的数量。D。对指定的小鼠队列进行Kaplan-Meier生存分析（Log-Rank）。所有组均采用Holm-Sidak方法进行多重比较（显著性水平=0.05），并发现用富含雷帕霉素的Tregs进行处理的小鼠与所有其他组之间存在显著差异。
图6
图6。在雷帕霉素存在的情况下，OX40共刺激促进CD28介导的T调节扩增，但通常导致抑制活性的丧失
A。2×105用以细胞为基础的aAPC刺激富集的Tregs，在雷帕霉素存在下传递指示的共刺激信号，并通过细胞计数测量种群倍增率。每个数据点代表三个独立实验的平均值（误差条代表标准偏差）。B和C。Foxp3表达细胞百分比散点图(B类)和体外抑制活性(C类)用指示的基于细胞的aAPC刺激培养两周后测量。每个点代表一个单独的实验和细胞供体。还指出了平均值和标准偏差。
图7
图7。重新刺激T调节细胞可使其膨胀1000倍以上，而不会损失在体外或体内抑制活性
A。2×105富集的Tregs被K64.86 aAPCs刺激，并在雷帕霉素存在下扩张。用细胞计数法测定群体倍增率。每个数据点代表三个独立实验的平均值（误差条代表标准偏差）。当细胞膨胀到平台期时，用K64.86细胞基aAPC（开环）或单独培养（填充成圆圈）重新刺激培养物。B。培养14天后，在雷帕霉素存在下用K64.86 aAPCs刺激一次或两次的富集Tregs，分析Foxp3和CD25的表达。数据是四个独立实验的代表。C、。这个在体外细胞群的抑制活性A类和B类通过混合CFSE标记的自体PBMC、抗CD3抗体包衣珠以及扩张的Tregs和PBMC的指示比例进行测量。培养4天后，用流式细胞仪测定CFSE稀释度。D。2×106A中显示的每个培养物的细胞与1×10混合7自体PBMC并注射入NOG小鼠（每组6只小鼠）。8周后，给小鼠放血，并测定人CD8 T细胞/μl血液的数量。
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