Cell cycle arrest by kynurenine in lens epithelial cells

doi:10.1167/iovs.08-2374

.2008年12月；49(12):5466-75.

doi:10.1167/iovs.08-2374。 Epub 2008年8月1日。

犬尿氨酸对晶状体上皮细胞周期的阻滞作用

马内什·梅兰科特¹, 道恩·史密斯, 斯科特·豪厄尔, 王本莲（Benlian Wang）, 詹姆斯·雅各布伯格, 塔米·斯特凡, 拉姆·纳加拉杰

附属公司

PMID： 18676626
PMCID公司：下午2610264
内政部： 10.1167/iovs.08-2374

犬尿氨酸对晶状体上皮细胞周期的阻滞作用

马内什·梅兰科特等。投资眼科视觉科学. 2008年12月.

.2008年12月；49(12):5466-75.

doi:10.1167/iovs.08-2374。 Epub 2008年8月1日。

作者

马内什·梅兰科特¹, 道恩·史密斯, 斯科特·豪厄尔, 王本莲（Benlian Wang）, 詹姆斯·雅各布伯格, 塔米·斯特凡, 拉姆·纳加拉杰

附属

¹美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学眼科和视觉科学系。

PMID： 18676626
PMCID公司：下午2610264
内政部： 10.1167/iovs.08-2374

摘要

目的：吲哚胺2，3-二加氧酶（IDO）介导的色氨酸氧化产生犬尿氨酸（KYNs），这可能在白内障的形成中发挥作用。KYN引起细胞变化的分子机制尚不清楚。研究了KYNs通过过度表达人IDO对小鼠晶状体上皮细胞的影响。

方法：使用来自人类IDO过度表达半合子转基因（hemTg）和野生型（Wt）小鼠的晶状体上皮细胞（mLECs）。IDO活性通过HPLC定量犬尿氨酸（KYN）进行测定。免疫细胞化学检测KYN介导的蛋白修饰，ELISA检测。用商用试剂盒测量细胞增殖和凋亡。用流式细胞仪分析细胞周期各期之间的细胞分布。免疫沉淀和LC/MS用于鉴定犬尿蛋白修饰蛋白。

结果：来自hemTg动物的mLECs显示出相当大的IDO免疫反应性和酶活性，而在Wt-mLECs中几乎检测不到。在hemTg中检测到KYN和KYN介导的蛋白修饰，但在Wt-mLECs中未检测到；修饰蛋白为肌球蛋白II和α/γ-肌动蛋白。HemTg-mLECs的活性和增殖降低。hemTg-mLEC培养物的细胞周期分析显示，与Wt-mLECs相比，G（2）/M期或两个时期的细胞数量大约增加了两倍。用hemTg mLECs中的1-甲基-d，l-色氨酸阻断IDO活性可阻止KYN形成、KYN介导的蛋白质修饰和G（2）/M阻滞。

结论：mLECs中过量的IDO活性会导致KYN生成、KYN介导的肌球蛋白II和α/γ-肌动蛋白修饰以及细胞周期扰动。KYN对肌球蛋白II和γ-肌动蛋白的修饰可能会干扰胞质分裂，导致上皮细胞分裂缺陷，从而导致纤维细胞数量减少。

PubMed免责声明

数字

图1
mLECs的特性。对分离的Wt和hemTg mLECs进行免疫染色αA类/αB-晶体蛋白(红色)在存在（测试）和不存在（控制）小鼠抗αA类/αB-晶体蛋白单克隆抗体。用DAPI对细胞进行复染(蓝色). 这些图像代表了三只老鼠的三种独立文化。

图2
IDO在Wt和hemTg mLECs中的表达。(A类)蛋白质印迹分析。用小鼠抗IDO单克隆抗体在hemTg-mLECs中检测到IDO，但在Wt-mLECs.中未检测到。GAPDH被用作负荷控制。(B类)IDO的免疫细胞化学。用单克隆抗体和德克萨斯红结合二级抗体在hemTg mLECs中检测到IDO。这些细胞也用阴茎倍肽染色以检测F-actin(绿色)并用DAPI复染(蓝色). 数据代表了三个独立实验的结果。

图3
KYN修饰蛋白的免疫染色。使用单克隆抗体和德克萨斯红结合二级抗体检测KYN修饰蛋白。用指骨肽对细胞进行F-actin染色(绿色)和带DAPI的细胞核(蓝色). KYN修饰蛋白(红色)在KYN处理的mLECs中检测到，但在未处理的细胞中未检测到。数据代表了三个独立实验的结果。

图4
KYN和我-培养基中的色氨酸。Wt和hemTg mLECs培养3天，收集无细胞培养基，冷冻干燥并处理以测量IDO活性。KYN和我-色氨酸通过HPLC定量。(A类)培养基中的KYN。在hemTg-mLEC培养基中检测到KYN，但在Wt-mLECs培养基中未检测到KY。(B类)我-培养基中的色氨酸。我-在hemTg-mLECs培养基中，色氨酸含量略有下降，而Wt-mLECs.培养基中色氨酸的含量没有下降。结果显示为三个独立实验的平均值±SD。

图5
外源性KYN对mLECs细胞内KYN和KYN修饰的影响。(A类)将来自Wt的mLECs与0至1.0 mM KYN孵育3天。细胞被裂解，蛋白质沉淀，无蛋白上清液中的KYN被HPLC估计。结果是三个独立实验结果的平均值±SD。(B类)Wt mLECs与50μM KYN染色3天，并对KYN修饰的蛋白质进行免疫染色。KYN修饰蛋白(红色)在KYN处理的mLECs中检测到，但在未处理的细胞中未检测到。用指骨肽对细胞进行F-actin染色(绿色)和带DAPI的细胞核(蓝色). 图像是三个独立实验的代表。

图6
细胞增殖和细胞周期分析。(A类)细胞增殖的MTT分析。存活的hemTg mLECs的数量低于Wt mLECs。用KYN处理Wt-mLECs可减少活细胞数，而MT处理hemTg-mLECs可增加活细胞数**P（P）*< 0.0001. 所示结果为三个独立实验的平均值±标准差。(B类)流式细胞术分析。hemTg-mLECs和KYN处理的Wt-mLECsG数量增加₂/M和4N G₁细胞。通过MT处理，hemTg-mLECs中的细胞周期扰动被归一化。R3、G₂/M+4N G公司₁; R4，4N标准+G₂/M。

图7
mLECs中的KYN修饰蛋白质。(A类)mLECs裂解物的SDS-PAGE。hemTg mLECs的细胞裂解产物显示Wt mLECs中不存在的高分子量蛋白质。(B类)免疫沉淀KYN修饰蛋白的SDS-PAGE。两种主要的KYN修饰蛋白(箭头)在hemTg mLECs裂解液中检测到。*车道M*：分子量标记；*车道1*：重量mLEC；*车道2*：hemTg mLEC。HC、IgG重链；LC，IgG轻链。

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[1] King NJ，Thomas SR.聚焦分子：吲哚胺2,3-双加氧酶。国际生物化学与细胞生物学杂志。2007年；39:2167–2172.-公共医学

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