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.2008年9月；36（16）：e105。
doi:10.1093/nar/gkn425。 Epub 2008年7月26日。

高通量DNA测序的超短读数据集中的重大偏差

朱利安·多姆 1, 克劳迪奥·洛塔兹, 塔蒂亚娜·博罗迪纳, 海因茨·希姆鲍尔
附属公司

高通量DNA测序的超短读数据集中的重大偏差

朱利安·多姆等。 核酸研究. 2008年9月.

摘要

新型测序技术允许快速生成大型序列数据集。这些技术可能会给遗传学和生物医学研究带来革命性的变化，但需要对超短读输出进行彻底的表征。我们生成并分析了两个Illumina 1G超短读数据集，即280万27mer的普通β基因克隆和1230万36mer的不动杆菌基因组。我们发现，错误率从读取开始时的0.3%到读取结束时的3.8%不等。错误的基址调用通常以基址G开头。基址替换错误频率变化10到11倍，其中A>C转换是最频繁的，C>G转换是最不频繁的替换错误。单个碱基的插入和缺失发生率非常低。在模拟重新排序时，我们发现20倍的排序覆盖足以通过正确读取来补偿错误。序列区域的读取覆盖率有偏差；在GC含量升高的时间间隔内，读取密度最高。Solexa高质量分数过于乐观，低分数低估了数据质量。我们的结果显示了不同类型的偏见以及检测它们的方法。这些偏差对Solexa数据的使用和解释、重新测序、单核苷酸多态性和DNA甲基化位点的鉴定以及转录组分析都有影响。

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数字

图1。
图1。
使用ELAND进行读取分析的饼图。ELAND类别为：QC：由于读取质量低，未进行匹配（两个以上位置的质量分数=−5），NM，未找到匹配；U0，找到唯一的精确匹配；U1，唯一匹配，一个错误；U2，具有两个错误的唯一匹配；R0，找到多个完全匹配项；R1，多个匹配，一个错误；R2，有两个错误的多次匹配。类别R0、R1、R2显示为单个实体。(一)27人阅读的ELAND分类普通β克隆ZR-47B15（共2 788 286个）。(b条)32人阅读的ELAND分类不动杆菌（总计12288 791个，由原始36mer数据的最后四个基本调用调整）。
图2。
图2。
Solexa读取覆盖率和GC内容的相关性。(一)27mer读取生成自普通β美国银行ZR-47B15(b条)32mer数据集来自不动杆菌基因组。每个数据点对应于1-kbp窗口记录的读取次数（移位100 bp in贝塔和1 kbp英寸幽门螺杆菌).
图3。
图3。
Solexa读取沿着参考序列的分布，考虑到ELAND报告的唯一匹配位置（零、一个或两个不匹配的碱基），以及使用Perl脚本检测到的多个匹配位置（无不匹配碱基）的读取。(一)沿普通βBAC序列（带有克隆载体pBeloBACII）。2 166 892 27mer读取与完成的序列相匹配（包含在克隆载体中，总计约117 kbp）。在200个连续的0.58 kbp窗口中计算读取覆盖率。(b条)沿1.55 Mbp读取分布幽门螺杆菌基因组，基于87001132mer读数。本地覆盖率显示在7.77 kbp的200个连续窗口中。
图4。
图4。
Solexa读取中错误基址调用的频率取决于读取过程中的位置（27mer读取普通β32mer从幽门螺杆菌). (一)每个位置的错误频率仅考虑错误的基本呼叫。最大错误频率出现在读取3′端。(b条)超基准错误率（考虑到所有基本呼叫，每个位置的总错误频率）。
图5。
图5。
通过重新排序项目中的深度排序补偿排序错误。显示了不同覆盖级别的每kbp的平均错误数。对于低于2的覆盖范围，读取不太可能重叠，并且很少补偿排序错误（因此，当覆盖范围增加时，排序错误会累积）。对于3倍以上的覆盖范围，未补偿错误的数量随着覆盖范围的增加而迅速下降。
图6。
图6。
中读取的两个错误之间的距离幽门螺杆菌和普通β数据集。'“0”表示错误的基调用相邻。
图7。
图7。
Solexa读取中错误基调用的序列上下文不动杆菌和普通β，考虑到错误基址调用的上游和下游一个基址。“e”表示被替换的基。散点图显示了两个数据集的相对频率（将误差位置处的3元组的频率与读取中的所有3元组的频率相关）的相关性。
图8。
图8。
中的替换错误频率不动杆菌和普通βSolexa读取数据集。
图9。
图9。
所有正确基本调用的基本质量值直方图(一)和所有错误的基本呼叫(b条)在中贝塔和幽门螺杆菌数据集。
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