A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors

doi:10.1073/pnas.0800487105

.2008年7月22日；105(29):10137-42.

doi:10.1073/pnas.0800487105。 Epub 2008年7月11日。

利用禽逆转录病毒载体建立基于Cre-loxP的小鼠体内条件性体细胞基因表达和敲除模型

芭芭拉·塞德勒¹, 安尼格雷特·施密特, 乌尔里希·迈尔, 哈桑·纳海, 罗兰·施密德, Günter Schneider公司, 迪特尔·索尔

附属公司

PMID： 18621715
PMCID公司： PMC2481330型
内政部： 10.1073/pnas.0800487105

利用禽逆转录病毒载体建立基于Cre-loxP的小鼠体内条件体基因表达和敲除模型

芭芭拉·塞德勒等人。美国国家科学院程序. 2008.

.2008年7月22日；105(29):10137-42.

doi:10.1073/pnas.0800487105。 Epub 2008年7月11日。

作者

芭芭拉·塞德勒¹, 安尼格雷特·施密特, 乌尔里希·迈尔, 哈桑·纳海, 罗兰·施密德, Günter Schneider公司, 迪特尔·索尔

附属

¹德国慕尼黑伊斯曼尼斯特拉斯22号慕尼黑科技大学内科2部，邮编81675。

PMID： 18621715
PMCID公司： PMC2481330型
内政部： 10.1073/pnas.0800487105

摘要

利用禽肉瘤-白血病逆转录病毒RCAS（具有复制能力的禽肉瘤/白血病病毒长末端重复序列和剪接受体）进行定点和时间特异性体细胞基因转移已被证明是分析体内基因功能的有力工具。表达禽A亚群包膜的RCAS逆转录病毒只转导经基因工程表达禽逆转录病毒受体肿瘤病毒A（TVA）的哺乳动物细胞。在这里，我们通过靶向Rosa26基因座产生了一种称为LSL-R26（Tva-lacZ）的敲除小鼠系，同时伴有Tva和lacZ的条件表达。使用loxP侧翼转录终止盒以Cre-regusiondependent方式对TVA和LacZ表达进行条件激活。为了证明该系统在体内条件体细胞基因转移的能力，我们将TVA表达导向胰腺。引入带有Bryan-RSV聚合酶的RCAS载体和携带致癌Kras（G12D）的A亚群包膜[RCASBP（A）]，可诱导局部导管胰腺病变，再现进展为胰腺导管腺癌的人类胰腺上皮内瘤变。通过携带针对小鼠TP53的短发夹RNA的RCASBP（A）病毒，TVA介导的胰腺祖细胞内源性表达Kras（G12D）的基因工程小鼠感染，导致侵袭性腺癌的进展显著增强。这些结果表明，TVA的条件表达能够在体内体细胞的一小部分中实现时空基因表达和敲除。因此，它密切模拟了人类的致癌过程，其中肿瘤是由发育正常细胞中的体细胞基因突变演变而来的。结合越来越多的Cre表达模型，基于RCAS-TVA-的基因表达和敲除系统为在体外和体内以时间控制和组织特异的方式分析基因功能开辟了前景。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
的特征*LSL-R26型^{Tva-lacZ公司}*敲小鼠。(A类)E13.5的全贴装X-Gal染色*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+};*Prm Cre公司*(左侧)和*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+}(赖特)胚胎。(B类和C类)胰腺切片中的核lacZ活性(B类)和肝脏(C类)与成人隔离*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+};*Prm-Cre公司*鼠标。(*D–G型*)lacZ活动的可视化*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+};*Ptf1a公司*/*第48页*^Cre公司/+老鼠。X-Gal染色的肝脏和胰腺的宏观图像(D类)小肠和胰腺(E类)E18胚胎。胰腺切片中核lacZ活性的显微图像(F类)和肝脏(*G公司*)成年小鼠。(*H（H）*)X-Gal染色显示成人胰腺切片中没有lacZ活性*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+}鼠标（控件）。(*I–K型*)成人胰腺TVA（棕色）免疫染色*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+};*Ptf1a公司*/*第48页*^Cre公司/+(我和J型)和控制*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+}(*K（K）*)鼠标。TVA表示为胰岛（数据未显示）、导管（中的黑色箭头J型)和腺泡(我和J型)，但不包括邻近淋巴结（Ln in我). (*左旋-右旋*)lacZnls和TVA在乳腺癌mPanIN病变中的表达*Ptf1a公司*/*第48页*^Cre公司/+;*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+};*LSL-Kras公司*^G12D系列/+动物。苏木精和曙红（H&E）(*L（左）*)，X-加仑(*M（M）*)和免疫组织化学TVA(N个)胰腺切片染色显示核lacZ的表达(*M（M）*)和TVA(N个)在mPanIN病变中（黑色箭头），但不在促结缔组织增生性基质中（黑色的箭头）。(*O–Q公司*)TVA和lacZnls在小鼠PDAC中的表达*Ptf1a公司*/*第48页*^Cre公司/+;*LSL-R26型*^{Tva lacZ型/+};*LSL-Kras公司*^G12D系列/+;*LSL-TP53型*^172H兰特/+动物。X-加仑(*O（运行）*)和免疫组织化学TVA(*P（P）*和问)原发性掌上电脑切片染色(*O（运行）*和*P（P）*)和肝转移(问)PDAC（黑色箭头）中显示细胞核lacZ和TVA的表达，但不显示促结缔组织增生基质(*O（运行）*和*P（P）*; 黑色箭头）或邻近正常肝脏(问; 黑色箭头）。

**图2。**
TVA的异位表达使小鼠细胞对逆转录病毒RCASBP（A）介导的体细胞基因转移敏感体内. (*A–N*)胰腺、mPanIN病变和PDAC的逆转录病毒转导体内。小鼠通过注射DF-1 RCASBP（A）-EGFP细胞感染，如*材料和方法*.胰腺的连续冰冻切片*Ptf1a公司*/*第48页*^Cre公司/+;*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+}(A类和B类)和*Ptf1a公司*/*第48页*^Cre公司/+;*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+};*LSL-Kras公司*^G12D系列/+(*C–F类*)动物为DAPI(*A、 C类*，以及E类)或H&E(*B、 D类*，以及F类)染色并受到荧光(A类,C类，以及E类)和白光(B类,D类，以及F类)成像。(*G–L*)RCASBP（A）-EGFP感染的宏观视图*Ptf1a公司*/*第48页*^Cre公司/+;*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+};*LSL克拉斯*^G12D系列/+;*LSL-TP53型*^172H兰特/+转移性PDAC小鼠。荧光立体显微镜观察PDAC的EGFP表达。荧光灯(*G–I型*)以及相应的白光(*J–L型*)主PDAC的图像(*G公司*,*H（H）*,J型，以及*K（K）*)和肝转移(我和*L（左）*). (*M（M）*和N个)显微镜荧光(*M（M）*)和白光(N个)DAPI的图像(*M（M）*)和H&E(N个)RCASBP（A）-EGFP感染的原发性PDAC的染色连续冰冻切片*Ptf1a公司*/*第48页*^Cre公司/+;*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+};*LSL-Kras公司*^G12D系列/+;*LSL-TP53型*^172H兰特/+鼠标。

**图3。**
逆转录病毒RCASBP（A）-Kras^G12D系列感染导致mPanIN损伤和PDACPtf1a公司/*第48页*^Cre公司/+;*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+}老鼠。(A类)2日龄小鼠（P2）感染RCASBP（A）-Kras^G12D系列或RCASBP（A）-EGFP作为控制，如*材料和方法*。在指定的时间点对小鼠进行分析。RCASBP（A）-Kras中mPanIN和PDAC的开发^G12D系列-指示受感染的动物。(*B–D类*)经H&E染色的胰腺石蜡切片*Ptf1a公司*/*第48页*^Cre公司/+;*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+}感染RCASBP（A）-Kras 9个月后的小鼠^G12D系列显示类似mPanIN1A的局灶性导管病变(B类)和mPanIN2(C类和D类). (E类和F类)19个月龄RCASBP（A）-Kras中PDAC的宏观视图^G12D系列-感染小鼠。黑色箭头表示胰腺结节(E类和F类). 黑色箭头表示肝转移(F类). (*G–I型*)早期H&E染色(*G公司*)和高级PDAC(*H（H）*)和肝转移(我)产生于*Ptf1a公司*/*第48页*^Cre公司/+;*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+}感染RCASBP（A）-Kras的小鼠^G12D系列. (J型)CK-19免疫组织化学显示在分化良好的原发性PDAC中有强烈的染色。

**图4。**
RCAS介导的TP53下调加速内源性癌基因Kras表达小鼠PDAC的形成^G12D系列在胰腺中。三周大*Ptf1a公司*/*第48页*^Cre公司/+;*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+};*LSL-Kras公司*^G12D系列/+按照材料和方法一节中的描述，用携带针对小鼠TP53的短发夹RNA[RCASBP（A）-shTP53]或对照shRNA[RCASP（A）-shControl]的RCASBPA病毒感染小鼠。(A类)Kaplan–Meier生存曲线*Ptf1a公司*/*第48页*^Cre公司/+;*LSL-R26型*^{Tva-lacZ公司/+};*LSL克拉斯*^G12D系列/+感染RCASBP（A）-shTP53（红色方块）或RCASBP(*P（P）*= 0.0064; 对数库测试）。(*B–D类*)PDAC的宏观视图(B类; 黑色箭头），肝转移(B类和C类; 黑色箭头）和肺转移(D类; 黑箭头）。(*E–G公司*)初级PDAC的H&E染色石蜡切片(E类)，肝脏(F类)、和肺(*G公司*)转移。

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