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.2008年8月；118(8):2722-32.
doi:10.1172/JCI33713。

角质细胞特异性Smad2消融导致皮肤癌形成和进展过程中上皮-间质转化增加

克里斯蒂娜·胡特 1, 杰西卡灯塔, 韩刚文, 石龙路, 李亚伦（Allen Li）, 文君居, 莫莉·库莱斯·马丁, 埃尔文·博廷格, 王晓静
附属公司

角质细胞特异性Smad2消融导致皮肤癌形成和进展过程中上皮-间质转化增加

克里斯蒂娜·胡特等人。 临床研究杂志. 2008年8月.

摘要

TGF-β及其信号传导介质Smad2、-3和-4参与肿瘤抑制和促进功能。Smad4-/-小鼠表皮发生自发性皮肤鳞状细胞癌（SCCs），Smad3-/-小鼠对致癌物诱导的皮肤癌具有抵抗力；然而，Smad2在皮肤致癌中的作用尚未被探讨。在本研究中，我们发现Smad2和Smad4（而非Smad3）在人类SCC中经常丢失。与WT小鼠相比，角质形成细胞特异性Smad2缺失小鼠表现出化学诱导皮肤肿瘤的加速形成和恶性进展。与低分化人类SCC中Smad2的缺失一致，Smad2-/-肿瘤分化差，在自发Smad4缺失之前经历了上皮-间质转化（EMT）。Smad2-/-小鼠表皮中也发现E-cadherin的减少及其转录抑制因子蜗牛的激活，并且在Smad2-阴性人类SCC中发生的频率高于Smad2-阳性SCC。击倒蜗牛消除了Smad2缺失相关EMT，表明蜗牛上调是Smad2丢失相关EMT的主要介导者。此外，Smad2缺失导致Smad4与蜗牛启动子的结合显著增加，并击倒角质形成细胞中的Smad3或Smad4，消除Smad2丢失相关蜗牛过度表达。我们的数据表明，Smad3/Smad4介导的蜗牛转录增强在皮肤癌变过程中有助于Smad2丢失相关的EMT。

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数字

图1
图1。mRNA和LOH降低Smad2公司和Smad4公司在人类皮肤SCC中。
(A类)33例人皮肤SCC的qRT-PCR显示Smad2公司（31/33个样品）和Smad4公司（28/33例样本）表达与正常皮肤对照组相比。插图显示了控制和皮肤SCC的平均值**P（P）< 0.001. (B类)的LOHSmad2公司和Smad4公司在人类SCC中。微卫星标记D18S1137和D18S555用于评估Smad2公司LOH、D18S46和D18S1110用于评估Smad4公司哈哈。Het，杂合性；非信息性邻近组织显示纯合子。
图2
图2。加速肿瘤形成和皮肤癌变的恶性转化K5.Smad2公司-击倒老鼠。
(A类)肿瘤形成动力学。箭头表示TPA退出。停用TPA后，肿瘤的消退速度似乎更快Smad2公司+/–和Smad2公司–/–组与相比Smad2公司+/+这是因为有必要对肿瘤负担较高的小鼠实施安乐死。P（P）<0.001与K5.Smad2公司–/–或K5.Smad2公司+/–和Smad2公司+/+(B类)恶性转化动力学。Smad2公司+/–和Smad2公司–/–小鼠恶性转化率较高(P（P）与相比<0.05Smad2公司+/+老鼠）。在整个肿瘤动力学过程中，每个基因型的小鼠总数被用作所有时间点的分母A类和B类. (C类)肿瘤病理学和角蛋白标记物。H&E染色K5.Smad2公司–/–与对照组相比，肿瘤分化较少K5.Smad2公司+/+肿瘤。免疫荧光染色显示，在同一组织学阶段，Smad2公司+/+乳头状瘤（Paps）在基底上层表达K1（绿色），而K5.Smad2公司–/–乳头状瘤在基底层表达K8（红色），K1几乎丢失。虚线勾勒出基底膜。在SCC阶段，K5.Smad2公司–/–当肿瘤发展为梭形细胞癌时K5.Smad2公司+/+肿瘤为分化良好的SCC。底部2个面板中的矩形表示从SCC到SPCC的过渡区域。其中两个区域被放大了4倍，以说明这种转换（顶行，最右边的面板）。比例尺：100μm。
图4
图4。与脱分化和EMT相关的基因表达改变K5.Smad2公司–/–乳头状瘤和表皮。
(A类)K8-和EMT-相关分子mRNA表达上调K5.Smad2公司–/–乳头状瘤*P（P）与相比<0.05Smad2公司+/+乳头状瘤。(B类)E-cadherin的下调K5.Smad2公司–/–乳头状瘤。中的所有更改Smad2公司–/–乳头状瘤与Smad2公司+/+乳头状瘤*P（P）与相比<0.05Smad2公司+/+乳头状瘤。(C类)上调蜗牛和鼻塞mRNA输入K5.Smad2公司–/–表皮。‡P（P）与WT皮肤相比<0.01。(D类)E-cadherin的下调K5.Smad2公司–/–表皮。‡P（P）与WT皮肤相比<0.01。(E类)蜗牛敲除HaCaT细胞中单个Smad后的表达水平。#P（P）与TGF-β1模拟转染治疗相比，<0.05**P（P）与TGF-β1治疗的模拟转染相比<0.001。††P（P）与无TGF-β1的模拟转染相比<0.001。†P（P）与无TGF-β1的模拟转染相比<0.05(F类)鼻塞敲除HaCaT细胞中单个Smad后的表达水平。†P（P）与无TGF-β1的模拟转染相比，<0.05。
图3
图3。蜗牛活化和E-cadherin（ECad）丢失K5标准2–/–组织。
使用K14抗体进行复染（红色）。(A类)K5.Smad2公司–/–乳头状瘤进行EMT。当大多数细胞处于Smad2公司+/+乳头状瘤或自发性Smad4公司–/–SCC仍保留E-cadherin染色（绿色），K5.Smad2公司–/–乳头状瘤显示E-cadherin（绿色）明显缺失。箭头在K5.Smad2公司+/+图像显示E-cadherin缺失的斑块状区域，而箭头显示K5.Smad2公司–/–肿瘤显示E-钙粘蛋白斑片状滞留（上排）。在此阶段，蜗牛染色（绿色）主要是细胞质Smad2公司+/+乳头状瘤和自发性Smad4公司–/–SCC，但K5.Smad2公司–/–肿瘤显示核蜗牛染色（最下面一行）。比例尺：100μm。(B类)K5标准2–/–72小时后幼犬皮肤Smad2公司缺失表明E-cadherin（绿色，上排）显著减少，核蜗牛（绿色，下排）随之增加。K5.Smad4号机组–/–72小时后幼犬皮肤Smad4公司WT皮肤的E-cadherin和蜗牛表达模式没有改变。比例尺：100μm。
图5
图5。Smad2缺失的人类皮肤SCC与E-cadherin缺失和核蜗牛相关。
皮肤SCC染色Smad2 IHC（棕色，顶行），免疫荧光染色E-cadherin（绿色，中行）和蜗牛（绿色，底行）。K14抗体用于免疫荧光复染（红色）。来自连续切片的一对SCC的例子表明，Smad2阳性的SCC保留了膜相关的E-cadherin和少量蜗牛核染色细胞。相反，Smad2缺失的SCC丢失了膜相关的E-cadherin，但在细胞核中均匀表达蜗牛。比例尺：100μm。
图6
图6。蜗牛导致Smad2缺失-相关EMT。
Smad2公司与模拟转染相比，敲低导致Snail核染色（绿色）增加，并导致E-钙粘蛋白（绿色）膜染色丢失，HaCaT角质形成细胞中具有更多的纺锤体样形态。使用K14抗体进行复染（红色）。蜗牛siRNA转染细胞中残留的蜗牛染色可能是由于抗体与Slug的交叉反应。E-cadherin染色的模式与模拟对照相似。Smad2公司与Smad2公司siRNA转染细胞并恢复膜E-cadherin染色。相位对比照片显示了模拟转染或蜗牛siRNA转染细胞的上皮形态。上皮形态消失Smad2公司siRNA–转染细胞，但通过与蜗牛siRNA共同转染恢复。比例尺：20μm。
图7
图7。Smad3/Smad4介导的蜗牛转录增加导致Smad2缺失相关的蜗牛过度表达。
(A类和B类)来自染色质免疫沉淀（IP）的比较PCR显示，Smad4与蜗牛启动子的结合在Smad2公司–/–与WT皮肤相比。残余Smad2结合Smad2公司–/–皮肤来源于整个皮肤的非角质形成细胞群。Smad3与蜗牛启动子的结合在Smad2公司–/–皮肤与WT皮肤相比。Smad4与蜗牛启动子的结合在Smad2公司–/–皮肤*P（P）< 0.05. (C类)双重击倒Smad2公司和Smad3公司或Smad2公司和Smad4公司废除Smad2公司缺失相关蜗牛过度表达。Smad2公司击倒（48小时）导致蜗牛表达显著增加。击倒Smad4公司单独导致蜗牛表情减少。同时击倒Smad2公司和Smad3公司或Smad2公司和Smad4公司将蜗牛的表达降低到模拟转染水平。†P（P）与模拟转染相比，<0.05。‡P（P）与相比<0.05Smad2公司siRNA治疗。
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