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.2008年7月14日；182（1）：35-9。
doi:10.1083/jcb.200712124。 Epub 2008年7月7日。

氨酰化调节层粘连蛋白A的功能，并在与家族性心肌病相关的层粘连蛋白质A突变体中丢失

张玉倩 1, 凯文·德萨奇
附属公司

氨酰化调节层粘连蛋白A的功能，并在与家族性心肌病相关的层粘连蛋白质A突变体中丢失

张玉倩等。 J细胞生物学. .

摘要

拉敏蛋白A突变可导致多种疾病，包括心肌病和早衰综合征。小泛素样修饰物（SUMO）多肽的共价连接调节许多蛋白质的功能。到目前为止，还没有发现在sumoylation共识序列和sumoylion改变序列中发生人类致病突变的例子。我们发现，层粘连蛋白A在赖氨酸201处被酰化，并且与家族性扩张型心肌病相关的两个层粘连蛋白质A突变体E203G和E203K表现出酰化降低。E203在sumoylation共识Psi KXE中占据保守的+2位置。拉明A突变体E203G、E203K和K201R均表现出类似的异常亚细胞定位，并与细胞死亡增加有关。来自E203K层粘连蛋白A突变个体的成纤维细胞也表现出层粘连蛋白质A sumoylation降低和细胞死亡增加。这些结果表明，SUMO修饰对正常的层粘连蛋白A功能很重要，并暗示其参与E203G/E203K层粘连A心肌病中的sumoylation改变。

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数字

图1。
图1。
内源性层粘连蛋白A被酰化。（A） 使用抗层粘连蛋白A抗体对HeLa细胞提取物进行免疫沉淀，然后使用抗SUMO-2、SUMO-1或层粘连膜A抗体（与免疫沉淀不同）进行Western blot分析。（B） 使用抗-SUMO-2或-SUMO-1抗体对用于免疫沉淀的HeLa细胞裂解物进行Western blot分析。（C） 使用抗层粘连蛋白A抗体对从小鼠心脏制备的提取物进行免疫沉淀，然后使用抗SUMO-2、SUMO-1或层粘连蛋白质A抗体（不同于用于免疫沉淀的抗体）进行Western blot分析。
图2。
图2。
SUMO-2在赖氨酸201处对层粘连蛋白A进行酰化，E203G和E203K突变层粘连蛋白质表现出酰化降低。（A） 顶部显示了在层粘连蛋白A的杆状结构域中围绕赖氨酸201的sumoylation位点共识序列（ΨKXE）的匹配（MKEE）位置。底部，将转染GFP融合构建物的HeLa细胞提取物（野生型lamin A或K201R突变lamin A和HA标记的SUMO-1或-2质粒）用抗GFP抗体进行免疫沉淀，然后进行抗HA Western blot。使用抗GFP和抗HA抗体的裂解产物的蛋白质印迹显示GFP–层粘连蛋白A蛋白和HA–SUMO-1/HA–SUMO-2蛋白（并入主要的sumoylated蛋白中）的水平。（B） 顶部显示与家族性扩张型心肌病相关的层粘连蛋白A中E203G和E203K突变位于赖氨酸201周围的sumoylation位点共识序列（ΨKXE）的保守谷氨酸残基。在底部，用野生型层粘连蛋白A、E203G突变层粘连蛋白A或E203K突变层粘连蛋白A的GFP融合构建体转染的HeLa细胞的提取物以及HA标记的SUMO-2用抗GFP抗体进行免疫沉淀，然后进行抗HA蛋白质印迹。用抗GFP抗体通过Western blot测定细胞裂解液中转染GFP–laminA蛋白的水平。
图3。
图3。
SUMO位点K201R突变的层粘连蛋白A和心肌病相关的E203G和E203K突变的层黏连蛋白A表现出类似的异常定位模式。（A和B）将野生型、K201R、E203G和E203K层粘连蛋白A GFP融合表达质粒转染HeLa细胞（A）或小鼠胚胎心肌细胞（B），并通过共焦荧光显微镜检查GFP–层粘连蛋白质A的亚细胞定位。通过HOECHST 33342染色观察DNA。棒材，5μm。（C） 将野生型、K201R、E203G或E203K层粘连蛋白A-GFP融合表达质粒转染到HeLa细胞中，然后通过台盼蓝试验对其进行分析以测量细胞死亡。数据显示为平均值±SEM。（*，P<0.0001；**，P<00002；***，P<0.0001[针对层粘连蛋白A突变体与野生型]），每个数据集来自三个数据集。
图4。
图4。
E203K层粘连蛋白A突变个体的成纤维细胞表现出层粘连蛋白质A的sumoylation降低，层粘连蛋白酶A定位/核形态改变，细胞死亡增加。（A） 使用抗层粘连蛋白A抗体对从正常个体和杂合个体的皮肤成纤维细胞制备的E203K层粘连抗体A突变提取物进行免疫沉淀，然后使用抗-SUMO-2抗体或抗层粘着蛋白A抗体（不同于用于免疫沉淀的抗体）进行Western blot分析。（B） 使用抗层粘连蛋白a抗体对正常个体和E203K层粘连a突变杂合个体的皮肤成纤维细胞进行免疫荧光分析。通过HOECHST 33342染色观察DNA。棒材，5μm。（C） 用台盼蓝法分析正常人和E203K层粘连蛋白a人的皮肤成纤维细胞，以测定细胞死亡。数据显示为平均值±SEM（E203K层粘连蛋白A突变细胞与野生型细胞相比P<0.0038），来自三个数据集。
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