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.2008年7月2日；28(27):6996-7005.
doi:10.1523/JNEUROSCI.5268-07.2008。

创伤后GABA（A）介导的[Ca2+]i增加对于诱导成熟中枢神经元的脑源性神经营养因子依赖性存活至关重要

阿纳斯塔西亚·舒尔加 1, 朱迪思·托马斯·克鲁斯, 托马斯·西格尔, 安妮·布莱塞, 佩德罗·梅斯特雷, 米歇尔·梅耶尔, 乔艳, 凯凯拉, 马特·萨尔马, 克劳迪奥·里维拉, 克劳斯·M·吉尔
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创伤后GABA（A）介导的[Ca2+]i增加对诱导成熟中枢神经元脑源性神经营养因子依赖性存活至关重要

阿纳斯塔西亚·舒尔加等人。 神经科学. .

摘要

神经元损伤后，GABA（A）介导的反应从超极化转变为去极化，导致GABA介导的[Ca2+]（i）增加。此外，中枢神经元依赖BDNF生存。这两种机制是否有因果关系是一个悬而未决的问题。这里，我们在体外损伤的CA3海马神经元和体内切除的皮质脊髓神经元中显示，创伤后神经元特异性K-Cl协同转运体KCC2的下调导致Na-K-2Cl协同转运体NKCC1在细胞内积累氯离子，导致GABA诱导的[Ca2+]（i）瞬变。由于NKCC1抑制剂布美他尼阻断GABA（a）去极化可防止BDNF退出时神经元的丢失，因此，这一机制是神经元群体在损伤后以BDNF依赖性方式存活所必需的。恢复期间KCC2表达的恢复与BDNF生存依赖性的丧失相一致。这可能是通过BDNF本身介导的，因为受损神经元通过将BDNF诱导的KCC2下调转换为上调来逆转对该神经营养素的反应。

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数字

图1。
图1。
轴切断后，器官型海马脑片中的神经元依赖BDNF营养支持。A类左，典型器官型海马切片的Hoechst染色。比例尺，100μm。右侧示意图显示了Schaffer侧支的位置以及海马CA1、CA3和齿状回（DG）的不同区域。病变部位显示为虚线。B类代表性未损伤和损伤切片的NeuN免疫染色，以及用BDNF清除剂TrkB-Fc处理的损伤切片。比例尺，100μm。C类给予TrkB-Fc后，CA3区域的NeuN强度没有降低（非病变对照组的103±5%；第页> 0.1;n个= 14). 轴切断后，受损切片的NeuN表达没有减少（非损伤对照组的99±4%；第页> 0.1;n个=23），而TrkB-Fc治疗的受损切片的NeuN免疫反应性降低了13±2%（TrkB-F-c治疗组与未治疗组相比***第页< 0.001;n个= 24).n个，切片数。误差条指示SE。
图2。
图2。
病变诱导器官型海马脑片KCC2蛋白下调。A类代表性未病变和病变切片的KCC2免疫染色。比例尺，100μm。B类Western blot分析显示，KCC2而非NKCC1在损伤切片中下调。
图3。
图3。
阻断NKCC1抑制GABAA类-细胞内[Ca的介导性增加2+]我在受损神经元中。A类，Fluo-4在器官型海马脑片中的荧光。比例尺，100μm。B类，在未发酵切片中，使用谷氨酸而非麝香酚会引起[Ca增加2+]我.C类，在损伤切片中，100μ米麝香草酚引起[Ca增加2+]我NKCC1抑制剂布美他尼（10μ米) (D类).E类，在BDNF处理的未分解切片中，麝香酚引起[Ca2+]我，被布美他尼阻断。F类在用BDNF处理的切片中，麝香酚不会引起[Ca的增加2+]我.n个= 4. 误差条指示SE。
图4。
图4。
NKCC1区块及后续GABAA类-介导[Ca2+]我增加抑制损伤切片中BDNF依赖性的建立。损伤后立即应用布美他尼的后果，防止[Ca2+]我麝香酚诱发的增加，3d后可以观察到。误差条指示SE。
图5。
图5。
脊髓切断后，CSN依赖BDNF/TrkB营养支持生存体内.A类，损伤CSN的皮质脊髓损伤模型和神经营养因子治疗方案。左图，CSN的逆行追踪。在脊髓损伤前，将逆行示踪剂Fast Blue微量注射到脊髓颈C4/5水平的皮质脊髓束中，以明确标记CSN。中间，用刀在内囊水平上对CSN进行损伤，以导致CSN的轴索霉素诱导死亡。右，通过皮质内植入的治疗探头，通过硅管连接到渗透微型泵，进行实质内生长因子输送。治疗探头位于病变侧的额叶皮层。B类、用对照溶液（PBS）和受体阻断抗体（抗TrkB血清）处理的大鼠代表性切片的显微照片。我们使用1:7稀释血清来阻断TrkB。比例尺，1 mm。C类，TrkB信号对受损但未完整的大鼠CSN的存活是必需的[抗TrkB与PBS：**第页NKT后＜0.01；CSN存活率：PBS（67±2%，n个=11（对于损伤）；105 ± 4%,n个=4（对于完整的CSN），抗TrkB血清（抗-TrkB）（45±4%，n个=5（对于损伤）；100 ± 7%,n个=4（对于完整的CSN）]。D类，用BDNF-中和抗体治疗受损CSN导致受损CSN的存活率降低，但未受损CSN[CSN存活率：PBS（轴切），66±2%(n个= 12); 抗BDNF（轴切），41±9%(n个= 11); PBS（未授权），99±2%(n个= 5); 和抗BDNF（未经授权），97±5%(n个= 3)]. 在受损动物中，抗BDNF**第页NKT后与PBS相比<0.01。n个，动物数量。误差条指示SE。
图6。
图6。
急性损伤期后，存活神经元重建KCC2表达水平体内.A类，照片显示放射性检测到的KCC2 mRNA表达（黄色颗粒）就地损伤后第1天，在皮层V层进行杂交和快速蓝色标记CSN。比例尺，100μm。B类KCC2表达的时间进程表明，KCC2在轴切术后8 h已迅速下调，42 d后其表达水平恢复，KCC2 mRNA水平如下：8 h（64%；n个=1），1天（56±2%；n个=3），3d（51%；n个=1），5天（49%；n个=1），7天（51±11%；n个=4），42天（151±11%；n个= 3). 误差条指示SE。
图7。
图7。
BDNF使完整CSN中KCC2 mRNA的表达降低，而损伤CSN中的表达增加。A类，代表性显微照片，显示放射性检测到的KCC2 mRNA表达（黄色颗粒）就地PBS和BDNF处理的动物皮层V层中的杂交和快速蓝色标记CSN。比例尺，100μm。B类，通过快速蓝标记的CSN对颗粒进行定量。与相应对照组（对照组、PBS处理动物）的平均粒密度相比，BDNF使完整CSN中KCC2的表达减少40%，而使受损CSN中的KCC2表达增加180%。KCC2 mRNA水平的变化如下：完整CSNs：对照组，0±10%(n个= 3); BDNF，−41±8%(n个= 2); 轴切CSNs：对照，0±5%(n个= 3); BDNF，+183±43%(n个= 5).n个，动物数量。BDNF与对照**第页FLSD后<0.05。误差条指示SE。
图8。
图8。
BDNF的上调作用在轴切断后1天已经存在。A类照片显示，损伤后1天，PBS和BDNF处理的动物的皮层第V层KCC2 mRNA表达和Fast Blue-labeled CSN。比例尺，100μm。B类与损伤后1和7天对侧（载具）相比，BDNF治疗增加了KCC2水平。KCC2 mRNA水平如下：载体（PBS），1d（81±9%；n个=2），7天（66±11%；n个= 5); BDNF:1d（119±19%；n个=2），7天（121±28%；n个= 5).n个，动物数量。BDNF与PBS（1和7天）：**第页FLSD后<0.05。误差条指示SE。
图9。
图9。
BDNF诱导未损伤海马切片中KCC2的下调和损伤海马切片中KCC2的上调。在无BDNF和有BDNF的情况下，对代表性未损伤和损伤切片进行KCC2免疫染色。比例尺，100μm。
图10。
图10。
总结本研究结果和结论的示意图。有关详细信息，请参阅讨论。
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