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。2008年6月；6(6):965-77.
doi:10.158/1541-7786.MCR-07-2036。

活性ras通过过度刺激大胞饮作用触发胶质母细胞瘤细胞死亡

让·奥弗迈耶 1, 阿帕娜·考尔, 艾琳·E·约翰逊, 威廉·A·马耳他
附属公司

活性ras通过过度刺激巨噬细胞而触发胶质母细胞瘤细胞死亡

让·奥弗迈耶等人。 摩尔癌症研究。 2008年6月。

摘要

活化Ras在胶质母细胞瘤细胞中的表达导致大的相移细胞质空泡积聚，随后细胞死亡。这以前被描述为自噬细胞死亡。然而，与自噬体不同，Ras诱导的液泡不受双层膜的限制，也不隔离细胞器或细胞质。此外，它们不是酸性的，不含自噬体膜蛋白LC3-II。这里我们显示液泡是扩大的大松果体。它们快速结合细胞外液相示踪剂，但不隔离转铁蛋白或内体蛋白EEA1。最终，表达活化Ras的细胞从基质上脱落并破裂，这与细胞质被巨大的大松果体衍生的液泡移位一致。这些变化伴随着caspase激活，但广谱caspase抑制剂羧苯氧基-Val-Ala-Asp-氟甲基酮不能阻止细胞死亡。此外，大多数退化细胞没有出现典型的凋亡染色质凝集。这些观察结果为大胞饮失调引发的坏死样细胞死亡提供了证据，我们称之为“methuosis”。Rac1 GTPase的激活形式诱导类似形式的细胞死亡，提示Ras通过Rac依赖的信号通路在胶质母细胞瘤中过度刺激大胞饮作用。对这些信号通路的进一步研究可能会导致识别这种不寻常形式的细胞死亡的其他化学和生理触发因素。

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图1
图1
活化H-Ras的表达诱导U251胶质母细胞瘤细胞的细胞质空泡化和死亡。（A） 在第0天（电镀后24小时），将U251-C18胶质母细胞瘤细胞切换到含有1μg/ml多西环素（+Dox）的培养基中，或维持在不含Dox的培养基上。Western blot显示在添加Dox后的平行培养物中每隔一段时间myc标记的H-Ras（G12V）的表达。相同培养物的相差显微镜显示，在表达Ras（G12V）的培养物中，细胞质空泡大量堆积。（B） MTT分析显示，表达H-Ras（G12V）的培养物中的活细胞数量下降。每个点代表在最初以5000个细胞/孔接种的96 well平板中的四个单独培养物上进行的测定的平均值（±S.D.）。将MTT直接添加到培养基中以避免失去分离的细胞。（C） 现场与在添加Dox后的第4天和第7天，对从3个平行培养基中收集的分离细胞进行死亡荧光分析。在第7天收集来自相同培养物的附着细胞。每次测定50个细胞。（D） 在含有或不含Dox的培养基中培养6天后，对附着或分离的细胞进行ATP检测。结果是对三种不同培养物进行测定的平均值（±S.D.）。（E） 按照材料和方法中的描述，对细胞进行集落形成分析。电镀24小时后，将培养物切换至含有或不含Dox的培养基。3周后，计数具有＞50个细胞的菌落。结果是4块板的平均值±S.D。
图2
图2
活化Ras诱导的空泡与自噬体不同。（A） 用myc-H-Ras（G12V）逆转录病毒感染U251细胞，诱导其产生液泡，两天后进行电镜检查。液泡（V）具有电子透明性，比典型的双膜自噬体大得多（用黑色箭头表示）。白色箭头指向核膜，N表示细胞核。每个面板中的条形为1μ。（B） 瞬时表达myc-H-Ras（G12V）的核表达U251细胞与识别内源性LC3（上面板）和myc表位（下面板）的抗体共同染色。星号标记同一字段中不表达myc标记Ras的单元格。（C） 用Dox孵育4天的稳定U251-C18细胞的共焦图像，显示myc-H-Ras（G12V）（红色）和内源性LC3（绿色）（bar=10μ）的明显定位。（D） 在表达Ras（G12V）的细胞中积累自噬体标记物LC3-II。电镀后第二天，将U251-C18细胞换成含有或不含Dox的培养基，如图所示。同时，培养物接受E64D和Pepstatin A（蛋白酶抑制剂）或DMSO（无抑制剂）。2天后进行免疫印迹分析，以确定材料和方法中所述的myc-Ras（G12V）、LDH和LC3-II的水平。上面板显示了记录myc-H-Ras（G12V）、LC3-II和LDH表达的代表性斑点（Alpha Innotech成像系统扫描）。下图显示了当在一式三份样品中定量LC3-II与LDH的比率时获得的结果。
图3
图3
抑制自噬前蛋白beclin-1的表达不会干扰Ras诱导的空泡化和细胞死亡。（A） 如前所述（16），生成表达非特异性（对照）或beclin-specific RNAi（beclin-KD）的U251细胞。用pCMV5对这些细胞进行核感染myc-H-Ras（G12V）表达载体或空载体，24h后检测。（A） Western blots显示myc-Ras（G12V）在对照组和beclin KD细胞中表达相同。beclin-1的表达减少了90%以上。每条车道上装载了等量的蛋白质。（B） 代表性细胞显示myc-H-Ras（G12V）在对照细胞和beclin KD细胞中的显著细胞质液泡中的免疫荧光定位。对照组和beclin KD细胞均出现细胞圆形和脱落。（C） 条形图显示了对照组和beclin KD培养物中液泡化细胞的百分比，如面板B所示。该值是通过随机显微照片中的100个细胞计数确定的，每个细胞的阈值为两个或多个液泡（直径>0.5μm），以获得阳性分数。（D） 稳定的tet诱导的U251-C18细胞系感染了慢病毒，慢病毒含有与人类独特区域相匹配的反向重复干环RNAi序列贝克林mRNA或与任何已知GenBank条目不匹配的“对照”序列。与对照组相比，Beclin KD细胞中Beclin敲除率大于90%。对照组和beclin KD细胞系按照图1图例中的描述，在有或无Dox的情况下培养。在添加Dox后的第六天，测定表达H-Ras（G12V）（+Dox）的对照和beclin KD培养物中附着细胞的数量，结果表示为不含Dox的平行培养物中粘附细胞数量的百分比。结果是来自三种培养物的单独测定的平均值±S.D。（E） 将来自U251-C18对照细胞系和beclin KD细胞系的等分细胞进行集落形成分析，添加或不添加Dox以诱导Ras（G12V）表达。在每组的三种培养物中计算菌落数。
图4
图4
Ras（G12V）在U251细胞中诱导的液泡具有大松果体的特征。（A） 相前驱液泡包含细胞外液相示踪剂Lucifer Yellow（LY）。在通过添加Dox诱导活细胞表达myc-H-Ras（G12V）后的第四天，用LY培养活细胞15分钟。（B） 将U251-C18细胞与LY孵育15分钟，并用流式细胞仪定量示踪剂的摄取。如有指示，在添加LY之前，用细胞松弛素D（Cyto D）预先培养细胞30分钟。（C）对表达myc-H-Ras（G12V）的附加U251-C18细胞进行电子显微镜检查，发现存在大量接近形成新生大松果体的跛足，如星号所示。比例尺代表1μ。（D） 包含液相示踪剂右旋糖酐-AF488的液泡与包含转铁蛋白-AF594的隔间分开。在用Dox诱导myc-H-Ras（G12V）后的第四天，将活的空泡细胞与指示的荧光探针孵育15分钟。相位和荧光显微照片显示了相同的细胞场。（E） 固定表达myc-H-Ras（G12V）的空泡细胞，并进行免疫荧光显微镜检查，以定位内体标记物EEA1。
图5
图5
Ras（G12V）在U251细胞中诱导的液泡与晚期内涵体和溶酶体不同。诱导U251-C18细胞表达myc-H-Ras（G12V）四天后，（A）用Lysotracker Red培养活细胞以标记酸性细胞室，或（B）用Magic Red-RR培养活细胞，以标记含有组织蛋白酶B活性的细胞室。（C） 固定表达Ras（G12V）的空泡细胞，并进行免疫荧光显微镜检查以定位LAMP1。（D） 表达Ras（G12V）的真空细胞用Lysotracker Red（红色）预孵育3 h，清洗，然后用右旋糖酐-AF488（绿色）孵育4 h。顶部面板中的相位图像显示了荧光图像中描绘的相同的细胞区域。
图6
图6
激活的Rac1在胶质母细胞瘤细胞中模拟激活Ras的作用。如方法所述，生成用于myc-Rac1（G12V）条件表达的稳定U251细胞系。（A） 在添加Dox后的第4天和第8天，使用针对myc表位的抗体通过免疫印迹分析检查myc-Rac1（G12V）的表达。（B） 相同培养物的相差显微镜显示，在表达Rac1（G12V）的培养物中，细胞质液泡大量积聚，细胞脱落。（C） MTT分析显示，与−Dox对照组相比，+Dox培养物中的活细胞数量下降。每个点代表在96 well板中的六种不同培养物上进行的测定的平均值（±S.D.）。（D） 表达Rac1（G12V）的U251细胞将LY并入相前导液泡。在添加Dox后的第四天，用LY培养细胞15分钟。显微照片显示了活细胞的相位对比图像与荧光图像的融合。
图7
图7
表达活化Ras的胶质母细胞瘤细胞的进行性变性涉及大松果体扩张和caspase的非必需激活。（A） 通过用Dox孵育稳定的U251-C18细胞来诱导myc-H-Ras（G12V）的表达。每两天更换一次培养基。在第4-7天收集分离的细胞。第7天收集附着细胞。作为PARP和层粘连蛋白a/C凋亡裂解的阳性对照，用staurosporine处理不含Dox的细胞24小时。免疫印迹显示PARP（上面板）和层粘着蛋白a/C（下面板）的裂解产物显示caspase激活。（B） 如图1所示，接种U251-C18细胞并在有或无Dox的情况下维持。从第4天开始，将一半的+Dox培养物换成含有50μM zVAD-fmk的DMSO培养基。−Dox培养物（无Ras表达）仅接受DMSO。第6天，采集附着和分离的细胞进行PARP免疫印迹分析。（C） 在第4天和第6天进行MTT分析，比较+Dox培养物和−Dox对照物中细胞的活力。每个结果都是在96 well板的四个孔上进行的分析的平均值±S.D。（D） Ras（G12V）表达诱导后4-6天收集的代表性分离U251-C18细胞的电子显微照片。N=原子核。比例尺为10μ。
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