Lin-28 interaction with the Let-7 precursor loop mediates regulated microRNA processing

doi:10.1261/rna.1155108

.2008年8月；14(8):1539-49.

doi:10.1261/rna.1155108。 Epub 2008年6月19日。

Lin-28与Let-7前体环的相互作用介导调节的microRNA加工

马丁·A·纽曼¹, J迈克尔·汤姆森, 斯科特·哈蒙德

附属公司

PMID： 18566191
预防性维修识别码： PMC2491462型
DOI（操作界面）： 10.1261/rna.1155108年

Lin-28与Let-7前体环的相互作用介导调节的microRNA加工

马丁·A·纽曼等。核糖核酸. 2008年8月.

.2008年8月；14(8):1539-49.

doi:10.1261/rna.1155108。 Epub 2008年6月19日。

作者

马丁·A·纽曼¹, J迈克尔·汤姆森, 斯科特·哈蒙德

附属

¹美国北卡罗来纳州教堂山市北卡罗来那大学细胞与发育生物学系，邮编：27599。

PMID： 18566191
预防性维修识别码： PMC2491462型
DOI（操作界面）： 10.1261/rna.1155108年

摘要

哺乳动物胚胎发育的一个标志是microRNA（miRNA）表达的广泛诱导。令人惊讶的是，许多这些小的非编码RNA的转录在发育过程中没有改变；相反，转录后调控事件阻止成熟miRNA物种的积累。在这里，我们提出了调控小RNA Let-7家族产生的生化框架。胚胎细胞含有Drosha抑制剂，可阻止Let-7初级转录物的处理。该抑制剂特异性地结合到Let-7前体环区的保守核苷酸，以及模拟结合位点恢复Let-7处理的竞争RNA。我们已将Drosha抑制剂鉴定为胚胎干细胞特异性蛋白Lin-28。Lin-28以前曾参与秀丽隐杆线虫的发育调控途径，并促进人体体细胞重编程为多能干细胞。我们的研究结果概述了microRNA转录后调控网络，并为microRNA前体环在成熟Let-7的调控生产中建立了新的作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
胚胎细胞含有一种Drosha抑制剂，可特异性调节Let-7。(左侧)如图所示，在P19或HeLa核提取物中培养与Let-7g和miR-17相对应的放射性标记的pri-miRNA底物。(赖特)Drosha蛋白或模拟蛋白是用多克隆抗体从P19核提取物中免疫沉淀而来。如图所示，固定化蛋白与Let-7g和miR-17 pri-miRNA底物孵育。Drosha内切酶产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上溶解。（箭头）生产Let-7g和miR-17前体。图中显示了标记的RNA寡核苷酸阶梯，以供尺寸参考。

**图2。**
Let-7的环区与Drosha抑制剂相互作用。(A类)Let-7家族成员的序列比对如图所示。（蓝色文本）成熟miRNA序列；（绿色文本）互补茎链（不完全是星形链）；（灰盒）同源区域；（箭头）被突变的核苷酸。序列变化显示在路线下方。(B)野生型（WT）或突变型pri-Let-7g底物与pri-miR-17底物结合，并在P19或HeLa核提取物中培养。解决了Drosha产品，并指出其存在。(C类)结合Let-7g和miR-17的Pri-miRNA底物，并在P19核提取物中培养。对应于每个茎环加上12 nt的竞争体RNA转录本，或竞争体2′-*O（运行）*-甲基寡核苷酸的最终浓度分别为10、50和250 nM。在一个案例中，寡核苷酸具有3′生物素部分。这个左边莱恩没有对手。Drosha产品在变性聚丙烯酰胺凝胶上溶解。（箭头）前体产品。

**图3。**
RNA结合蛋白Lin-28特异性地结合到Let-7环区。(A类)与Let-7d环或随机（对照）序列相对应的寡核苷酸捕获探针，完全2′-*O（运行）*-甲基修饰的3′生物素与链霉亲和素琼脂糖结合。从P19核提取物中捕获蛋白质，在4%–20%的聚丙烯酰胺凝胶上溶解，并用考马斯蓝染色。通过MALDI-TOF指纹图谱分离和鉴定蛋白质。(B)与Let-7d干环或miR-20a干环相对应的放射性标记RNA探针与P19核提取物孵育。如12.5、125或1250 nM所示，包括未标记的Let-7d环或对照寡核苷酸竞争物。蛋白质通过紫外光交联到探针上。通过与多克隆抗体的交联反应免疫沉淀Lin-28。如图所示，在聚丙烯酰胺凝胶上溶解总提取物（IP输入）和免疫沉淀。

**图4。**
Lin-28表达阻断Let-7的产生。(A类)如图所示，用MSCV逆转录病毒构建物转导NIH-3T3细胞，以驱动Lin-28、Lin-28B或对照的表达。感染后10天，使用定制微阵列平台定量稳定的miRNA表达水平。归一化测量值按层次聚类并绘制为热图。（黄色）相对于平均值，高表达，（蓝色）低表达。（红色字体）Let-7家族成员。(B)通过实时RT-PCR定量表达Lin-28、Lin-28B或对照的NIH-3T3细胞的稳定miRNA表达水平。使用U6 snRNA作为参考。pri-Let-7g的表达也通过实时RT-PCR进行定量。以β2-微球蛋白为对照。(C类)通过Northern印迹分析表达Lin-28、Lin-28B或对照的NIH-3T3细胞中Let-7g前体和成熟物种。(D类)用靶向Lin-28的siRNAs转染P19细胞。单独或联合使用两种有效的siRNA。转染5天后，通过实时RT-PCR测定成熟miRNA水平。U6被用作参考。pri-Let-7g的表达也通过实时RT-PCR定量。以β2-微球蛋白为对照。

**图5。**
Lin-28对于规范的Let-7处理来说是必要且充分的。(A类)结合Let-7g和miR-17的Pri-miRNA底物，并在HeLa核提取物中培养。纯化的、重组的NF-45（对照）或Lin-28以每次反应2、20和200 ng的剂量加入。Drosha产品在变性聚丙烯酰胺凝胶上溶解。（箭头）前体产品。重组蛋白产生于*大肠杆菌*. (B) (左侧多克隆Lin-28抗体或模拟抗体与蛋白A sepharose结合。P19核提取物与固定化抗体孵育。将产生的免疫缺失提取物与pre-miRNA底物孵育用于Let-7g和miR-17。(赖特将重组Lin-28以100 ng/μL最终浓度添加回免疫耗竭反应中。Drosha产品在变性聚丙烯酰胺凝胶上溶解。（箭头）前体产品。在HEK-293细胞中产生重组蛋白。

**图6。**
pri-Let-7的广泛序列保守性。显示了小鼠pre-Let-7g和pre-Let-1i干环序列的基因组位点，每侧包含600 nt侧翼。显示了30种脊椎动物的保护区。数据来自UCSC基因组浏览器，2007年7月发布。

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